瘤胃微生物类群的多样性及其综合发酵的研究进展

青贮发酵与瘤胃发酵具有基本相同的可利用基质但青贮窖是一次装料发酵产物也不能移出乳酸菌产生乳酸的积累使ph值降低以便抑制竞争者并最终抑制了自身的生长与繁殖故只有简单的几类微生物生长其中纤维素降解菌及其酶的活性对ph值也相对敏感所以容易受到影响朱伟云2004而不能再正常生长纤维素也不能被有效分解vanhoutert1993认为瘤胃微生物达到最大生长速度的适宜ph值57以上
ｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ） 在瘤胃中常被检测到。如降解淀粉为主的 Ｒ． ｂｒｏｍｉｉ（ Ｋｒａｕｓｅ 等， １９９９） ； 降解纤维为主的 Ｒ． ｆｌａｖｅ－ ｆａｃｉｅｎｓ 在孙 云章 （ ２００５） 的 研 究 中 占 测 序 克 隆 子 中 比 例 为 ２．０８％； 在 Ｋｒａｕｓｅ 等 （ １９９９） 报 道 中 占 有 ２．２％的 比例， 是以粗饲为主的反刍动物瘤胃中的常在菌类。
狭义遗传多样性是指种内基因的变化， 包括种内 Ｓｕｎｄｓｅｔ 等 （ ２００７） 对 ｒｅｉｎｄｅｅｒ 瘤 胃 微 生 物 １６Ｓ ｒＲＮＡ
ｇｅｎｅ 的测序结果表明 Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌｅｓ 的比例为
王梦芝 ， 扬 州 大 学 动 物 科 学 与 技 术 学 院 ， 博 士 ， ２２５００９， 江 苏省扬州市文汇路东路 １２ 号。
用于构建系统树的 １６Ｓ ｒＤＮＡ 序列 ６ ２０５ 个， 而随着 ｃｌｕｓｔｅｒｓ） （ Ｐｒｙｄｅ 等， ２００２） 。
研究的不断深入，还有新发现的序列不断上传，丰富瘤
瘤胃中除有种类繁多的革兰氏阳性菌外尚存在一
胃微生物的基因库，足以说明其遗传多样性的丰富。 定比例的同样种类繁多的革兰氏阴性菌（ 安登第，２００３） 。
和基因表达具有很大的差异。目前，据 １６Ｓ ｒＤＮＡ 序列 维二糖、蔗糖、淀粉和糖原等几种 ＣＨＯ， 主要产生或只 同源分析建立的核糖体小亚基 １６Ｓ ｒＤＮＡ 和 １８Ｓ ｒＤＮＡ 产生丁酸， 其 ＤＮＡ 的 Ｇ＋Ｃ 摩尔百分比是 ４２．３％。据
序列数据库（Ｔｈｅ ｒｉｂｏｓｏｍａｌ ｄａｔａｂａｓｅ ｐｒｏｊｅｃｔ， ＲＤＰ）中，有 １６Ｓ ｒＲＮＡ（ｒＤＮＡ）进化树分析属于梭菌聚类（ Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌ
分类表明厚壁菌门（ Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ，低 Ｇ＋Ｃ 革兰氏阳性菌） 约为 ５９．７％～７６．７％， 而 Ｂａｃｔｅｒｉｏｄａｌｅｓ 比例约为 ２２．５％～ ３４．４％， 另外还含有比例较少的 Ｓｐｉｒｏｃｈａｅｔｅｓ，Ａｃｔｉｎｏｂａｃ－
然完美发酵罐， 使得微生物能够最大限度的存在和进 ｔｅｒｉａ，和 Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ 等类群（Ｏｚｕｔｓｕｍｉ 等， ２００５； Ｓｕｎｄ－
《饲料工业》·２００８ 年第 ２９ 卷第 １５ 期
反刍动物营养
瘤胃微生物类群的多样性及其综合发酵的研究进展
王梦芝 徐爱秋 李世霞 王洪荣
反刍动物能将可再生资源类纤维素物质转化为动 显著不同的种群间和同一种群内的遗传变异（ 李璇，
物产品而被誉为“生物转化器”，但反刍动物本身并不 ２００４） 。如安登第（２００３）以序列相似率 ９７％为标准而界 能消化纤维素类物质， 所依赖的是与之共生的瘤胃微 定为同一种，在耗牛和晋南黄牛瘤胃微生物 １６Ｓ ｒＤＮＡ
降解菌、脂肪降解菌、酸利用菌和乳酸产生菌等多类 群 。Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ 门，梭 菌 纲（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ），梭 菌 目 （Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉ－ ａｌｅｓ）毛 螺 菌 科 （ Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ） 的 瘤 胃 球 菌 属 （ Ｒｕ－
原 虫 、真 菌 以 及 古 甲 烷 菌 等 。 其 生 物 量 巨 大 ，在 充 分 繁 殖时约占瘤胃液的 １０％。瘤胃微生物的物种极为多样， 每毫升瘤胃内容物中有不同种类细菌 １０１０～１０１１ 个、原 虫 １０５～１０６ 个、厌氧真菌（游离饱子数为 １０３～１０５ 包括 ６ 个属）和噬菌体（颗粒数为 １０５～１０６ 个）（Ｍａｃｋｉｅ，２０００）。
命； 在干旱的沙漠中长颈鹿能够采食高高的刺槐的嫩
细菌约占瘤胃生物量的 ５０％～８０％， 并在瘤胃发
叶，而娇小的犬羚则偏爱刺槐下的小草；在高寒的青藏 酵中起着决定性作用（ Ｈｕｎｇａｔｅ， １９６６） 。１６Ｓ ｒＤＮＡ 系统
高原，牦牛能够将粗糙的草类转化为优质蛋白。由此可 见，瘤胃微生物类群的多样和其发酵能力的强大，而这 一功能在很大程度上得益于宿主所提供的瘤胃这个天
原虫严格厌氧和因为体壁较薄而易自溶等原因 而使分离和培养十分困难， 而免培养的小核糖体分子 技术为其研究提供了新的渠道， 而且还可能发现新的 种类。如 Ｋａｍａｔｉ 等（２００３）用专一性的原虫引物 ＰＳＳＵ－ ３４２ｆ 扩增 １８Ｓ ｒＤＮＡ 并进行克隆测序结果表明： 其中 所 有 克 隆 序 列 和 ＧｅｎｅＢａｎｋ（ 基 因 库 ） 中 的 １０ 个 原 虫 序列有 ９３％～９８％的序列同源性， 且优势原虫种类因 日粮的不同而不同。而 Ｓｈｉｎ 等（ ２００４） 用 １８Ｓ ｒＲＮＡ 片 段测序则发现在瘤胃液分离出的可识别克隆片段中， 有 ６９．６％为内毛虫、３１．４％为贫毛虫， 同时 ３０．４％的克 隆片段是 ＧｅｎｅＢａｎｋ 没有匹配的。Ｓｙｌｖｅｓｔｅｒ 等（ ２００４） 采 用 实 时 ＰＣＲ 研 究 也 发 现 每 纳 克 ＰＣＲ 产 物 中 有 ６．９８×１０９ 个原虫 ｒＤＮＡ 拷贝， 而且还检测到 ７．２×１０５ 个 未知拷贝。Ｓｋｉｌｌｍａｎ 等（ ２００６） 利用 ＲＴ－ ＰＣＲ 和细胞计
徐爱秋、李世霞、王洪荣（通讯作 者）， 单 位 及 通 讯 地 址 同 第 一作者。
收稿日期： ２００８－ ０２－ ２５ ★ 国家自然科学基金项目（ 项目编号 ３０５７１３４４）
测序克隆的 ７６．７％， 而革兰氏阴性菌 Ｂａｃｔｅｒｉｏｄａｌｅｓ（ Ｐｒｅ－ ｖｏｔｅｌｌａ－ Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ 系 ） 的比 例 为 ２２．５％。Ｏｚｕｔｓｕｍｉ 等 （ ２００５） 的研究中牛瘤胃 Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ 和 Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ 分别 占 有 ３４．４％和 ２．６％的 份 额 ， 而 Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ 的 比 例 为 ５９．７％。早期报道已分离 ２００ 多个细菌种类，由此可见 细菌之种类极为复杂 （Ｈｕｎｇａｔｅ，１９６６；Ｂｒｙａｎｔ 和 Ｂｕｒｋｅｙ，
广义遗传多样性指地球上所有生物所携带遗传 如报道认为纤维降解菌在以野生牧养的驯鹿瘤胃中
信息的总和（常罡，２００４）。与高等生物相比， 微生物的 约 １５％～３５％（ Ｓｕｎｄｓｅｔ 等， ２００７） 。另外罗斯拜瑞氏菌属 遗传多样性表现的更为突出，不同种群间的遗 传物 质 能发酵包括木糖、半乳糖、棉子糖、葡萄糖、麦芽糖、纤
生物。不同的反列达 到 ９７％
能利用各种不同类型的纤维素资源， 甚至对其它物种 相似率而为同种， 说明其种内的遗传变异度之大、遗
来说是毒草的植物，也可能是一些反刍类的美食。如在 传多样性之丰。 南非 的热 带 雨林 貘 可以 利用 树 上 的 几 片 老 叶 维 持 物营养
王梦芝等： 瘤胃微生物类群的多样性及其综合发酵的研究进展
１９５３）， 但 瘤 胃 中 尚 有 大 部 分 不 可 培 养 菌 （ Ａｍａｎｎ 等 ， １９９５） 。如溶纤维丁酸弧菌在瘤胃中可利用的底物从 单糖到纤维素较为广泛， 也比较易于分离培养， 但有 些株系如在瘤胃中可以检测到有降解纤维素活性的 菌株在体外却难以培养成功， 表明瘤胃环境对其的重 要 性 。新 兴 的 分 子 生 物 学 的 研 究 扩 展 了 传 统 方 法 可 以 研究的微生物范围， 如大型瘤胃细菌 Ｑｕｉｎｅｌｌａ ｏｖａｌｉｓ 以前从未被培养成功， 但经过 １６Ｓ ｒＤＮＡ 序列分析而 被确定分类地位； 同时也表明其生物种类比原来认为 的更 加 复 杂 多 样 （ Ｋｒａｕｓｅ 等 ， １９９６） ， 如 原 来 认 为 是 同 种的菌株在遗传进化特性上可能相差甚远， 需要重新 分 类 ； 而 且 由 瘤 胃 混 合 微 生 物 １６Ｓ ｒＤＮＡ（ｒＲＮＡ）文 库 序列分析显示， 还有大量尚未认识的种类存在（ Ｔａｊｉｍａ 等，１９９９、２００７） 。Ｓｕｎｄｓｅｔ 等（２００７）测序发现在瘤胃细菌 的 １２１ 个克隆中有 ６ 个新菌株（ｃｌｕｓｔｅｒ ＸＩＶａ）。这些研 究都一致地表明细菌种类之丰富和可研究的有限性。 １．２ 瘤胃原虫
自 １８４３ 年 Ｇｕｒｂｙ 和 Ｄｅｌｆｏｕｎｄ 在牛瘤胃液中首次 发现纤毛原虫后， 在其它反刍动物瘤胃内也陆续发现 原虫。瘤胃原虫分为鞭毛原虫（ Ｆｌａｇｅｌｌａｔｅ ｐｒｏｔｏｚｏａ） 和 纤毛原虫（ Ｃｉｌｉａｔｅ ｐｒｏｔｏｚｏａ） 两大类。幼龄反刍动物由于 所食母乳或开食料中的可溶性糖类发酵迅速而产生 很多的挥发性脂肪酸， 使得瘤胃 ｐＨ 值较低， 此时瘤胃 中以鞭毛虫为主。随着食物结构的改变， ｐＨ 值逐渐上 升而利于纤毛虫生长。Ｆｏｎｔｙ 等（ １９８４） 研究表明，在出 生后 １５～２０ ｄ 时就有纤毛虫开始定植， ｐＨ 值在 ６．０ 时 内 毛 虫 开 始 定 植 ， 在 ６．５ 时 双 毛 虫 和 全 毛 虫 开 始 定 植， 而鞭毛虫逐渐消失， 成畜瘤胃内以纤毛虫为主。原 虫在瘤胃内容物中的数量虽少于细菌，但因其体积较 大，其生物量基本与细菌相当，因宿主个体不同约占瘤 胃微生物生物量的 ３０％～８０％而异 （Ｕｓｈｉｄａ 等， １９９６）。 其 中 全 毛 目（Ｈｏｌｏｔｔｒｉｃｈａ）和 旋 毛 目（Ｓｐｉｒｏｔｒｉｃｈｉｃｈａ）两 目 ２５ 个属约有百余种之多， 并以内毛虫和双毛虫最多， 约 占 纤 毛 虫 总 数 的 ８５％～９８％。Ｓａｎｔｒａ 等 （２００６）报 道 Ｅｎｔｏｄｉｎｉｏｍｏｒｐｈｉｄ 原虫 是总 量 的 ８３．５％， 其 平 均 大 小 为 ８５ μｍ×４３ μｍ（２～１６８ μｍ×１３～１０４ μｍ）； 而 Ｉｓｏｔｒｉｃｈｉ－ ｄａｅ 原虫则占一小部分的比例，其平均大小为 １０５ μｍ× ５２ μｍ（３９～１８１ μｍ×２３～１０８ μｍ）。赵旭昌等（ １９９７） 报道 健康羊瘤胃纤毛虫大、中、小比例为 １： ３．６： ２８．０。值 得注意的是纤毛虫因为个体大小的不均一性而容易 导 致 细 胞 计 数 与 蛋 白 测 定 结 果 有 所 差 异 （ Ｆａｉｃｈｎｅｙ 等， １９９７） 。本研究室在近期的研究中也发现羽毛粉的 原虫蛋白产量比玉米蛋白粉低， 但原虫密度却大于后 者， 因此进一步分类研究发现羽毛粉的中、小个体
行发酵活动。对瘤胃微生物的纤维素降解方面的文章 ｓｅｔ 等，２００７； Ｔａｊｉｍａ 等，２００７）。根据其功能可分为纤维降 较为常见， 而本文就微生物各类群的多样性和其在综 解菌、半纤维素降解菌、淀粉降解菌、果胶降解菌、蛋白
合发酵中的互作效应等的研究新进展作以一综述。 １ 瘤胃微生物的多样性
瘤胃是微生物生存和繁衍的乐园，包括瘤胃细菌、
Ｅｎｔｏｄｉｎｉｕｍ 比例较玉米蛋白粉的高， 而部分大中类群 比例较低， 又通过计算的原虫个体平均蛋白量（ 羽毛 粉 组 小 于 玉 米 蛋 白 粉 组 ） 而 证 实 和 量 化 了 （ Ｆａｉｃｈｎｅｙ 等， １９９７） 所指出的差异。
与细菌相比纤毛虫对不同微生态环境更为敏感 （高爱武，２００３； 朱文涛，２００５； Ｂｒｏｗｎ 等，２００６）。该类群与 宿主的共进化和自身条件的依赖性使其种群数量和构 成因地域、畜种、季节、食性、瘤胃 ｐＨ 值和稀释率等不 同各异，也可能在进化变异中产生新的种类。如苏格兰 高山草地放牧赤鹿、绵羊和驯鹿瘤胃纤毛虫夏秋季节 高于冬春季节，三种畜中绵羊的原虫量最低。Ｓａｎｔｒａ 等 （１９９８） 研究发现维持水平下山羊瘤胃的原虫的数量极 显著高于绵羊，并且其中全毛虫和旋毛虫比例较高。额 尔很巴雅尔（１９９４）研究表明，同地区山羊瘤胃纤毛虫的 数量（８．３５×１０５ 个／ｍｌ）高于牛和绵羊（３．２×１０５ 个／ｍｌ；２．３× １０５ 个／ｍｌ），种类则以牛瘤胃中最多，为 １６ 个属 ７４ 种；绵 羊为 １４ 个属 ６２ 种；山羊为 １２ 个属 ４４ 种。Ｄｅｈｏｒｉｔｙ 等 （２００３）从 １９９７～２００１ 年间收集非洲野生动物的瘤胃样 并测定其原虫的数量， 发现精料型的原虫数量大于中 粗料 型， 并 以 野 生 型 的 瘤 胃 原 虫 量 最 少 。Ｈｒｉｓｔｏｖ 等 （２００１）研究表明，中等精料水平转为高精料水平时 Ｅｎ－ ｔｏｄｉｎｉｕｍ 从 ８９％上升到 ９１％， 而在中等精料水平时存 在的其它种属却未能检出， 并认为 Ｅｎｔｏｄｉｎｉｕｍ 可以存 活 于 喂 以 高 精 料 水 平 日 粮 的 牛 瘤 胃 中 。Ｙａｎｅｚ Ｒｕｉｚ （２００４）研究则表明， 山羊 和羯 羊 在以 橄 榄叶 为日 粮 时 Ｈｏｌｏｔｒｉｃｈａ 完全没有检测到、Ｅｎｔｏｄｉｎｉｏｍｏｒｐｈｉｄａ 密度较 低，而 添 加大 麦和 明 豆 （ ｆａｂａ ｂｅａｎｓ） 后，Ｈｏｌｏｔｒｉｃｈａ 在 瘤 胃液中出现、Ｅｎｔｏｄｉｎｉｏｍｏｒｐｈｉｄａ 密度有显著增加。上述 表明了特定条件下原虫的种群结构与丰度都存在较 大的变异，表现了原虫群体的条件依赖性和适应性。