生物基高分子材料尼龙5单体5-氨基戊酸生物合成研究进展

生物技术2021年第3期C®川恋业科41
5KHUMI AERKUUnjMl.SCIENCE AND T KHN0W6Y 生物基高分子材料尼龙5单体
5-氨基戊酸生物合成研究进展
罗洲，崔华伟，涂文应，曹瑞琪，李强，苟兴华,程杰
(成都大学/农业农村部杂粮加工重点实验室，四川，成都,610106)
摘要：5-氨基戊酸(5AVA)是生物基聚酰胺材料尼龙5和尼龙6,5的单体。

尼龙5和尼龙6,5是重要的工程塑料，广泛应用于机械、化工、仪表、汽车等工业。

目前工业上合成5AVA主要使用化学合成,但是化学合成法无法满足市场对生物基聚氨酯材抖日益增长的需求，且化学合成法污■染大，对环境不友好。

因此，生物法合成5AVA引起了广泛关注。

本文综述了生物法合成5AVA的研究现状和发展前景。

生物合成法包括发酵法、全细胞催化法、生物酶法等。

总结了目前生物合成5AVA4种生物合成途径，对这4种生物合成途径的宿主、合成策略、产物浓度、得率等进行了总结和比较。

关键词：5-氨基戊酸;聚氨酯材料尼龙5；L-赖氨酸;赖氨酸a-氧化酶；生物合成
15-氨基戊酸概述
5-氨基戊酸(5AVA),英文名称为5-Amin­ovaleric acid,分子式为C5H11NO2,分子量为117.15。

5AVA溶于水，微溶于乙醇，不溶于乙醵和苯。

5AVA有1个氨基和1个竣基。

其化学结构如图1所示。

5AVA是一种生产尼龙5和尼龙6,5的潜在原料，也能用于合成戊二酸、$-戊内酰胺、1,5戊二醇和5-轻基戊酸等C5平台化学品。

目前工业上制备5AVA主要使用化学法。

一般采用戊内酰胺或戊内酰胺聚合物水解后精制而得。

这些方法与生物法相比反应条件苛刻,能耗大，设备腐蚀大,效率低,分离复杂。

因此开发生物基来源的5AVA生物合成路线具有重要的现实意义。

5AVA可用于合成新型人造纤维尼龙5等重要工程塑料，广泛应用于化工、轻纺等工业。

2016年，全球聚酰胺的市场约为240亿美元，预计到2022年，市场需求将超过300亿美元，平均年增长率将超过5.5%。

近年来随着合成生物学的快速发展,氨基酸产业在成本与产量上均取得了巨大突破。

微生物发酵生产天然氨基酸的成本持续降低，全球氨基酸产量预计到2022年将突破1100万t。

我国作为氨基酸生产和消费大国，大宗型氨基酸产品已处于供过于求的状态。

随着L_赖
收稿日期：2021-1-20
基金项目：农业农村部杂粮加工重点实验室开放基金(2020CC010)
作者简介:罗洲(1997-)，男，本科，研究方向:代谢工程及合成生物学。

E-mail：2353317748@。

*为通讯作者。

氨酸合成工艺的成熟和生产成本的降低，其产能严重过剩，导致市场售价大幅降低。

目前赖氨酸盐酸盐的市场价格约为1700美元/I,而5AVA约为37万美元/t,具有显著的经济效益。

因此，发展使用生物基L-赖氨酸作为初始原料生产高附加值产品的新型生物技术，具有重要的经济意义和社会价值。

图15AVA的化学结构
2微生物中5-氨基戊酸的生物合成路径
越来越多的环境污染、气候变暖和能源短缺等问题正在促进可持续绿色的生物制造发展。

利用微生物生产5AVA,可以减少对环境的污染，是符合国家和民族走可持续发展之路的新型制造方式。

由于5AVA及其衍生物具有广泛的应用前景,其合成已引起众多国内外研究者的兴趣，并开发出许多新的合成方法和技术。

目前,5AVA的生物合成主要有4种途径(图2~图5)。

其中,5-氨基戊酰胺介导合成5-氨基戊酸途径是最重要的途径，在恶臭假单胞菌中，L-赖氨酸通过两步酶催化反应转化为5AVA。

第二条途径是戊二胺介导合成5AVA途龟以L-赖氨酸为底物，通过三步酶催化反应转化为5AVA O第三条途径是2-酮-6-氨基己酸介导的赖氨酸a-氧化酶合成5-氨基戊酸途径，以L-赖氨酸为底物,经过一步酶催化转化为中间体2-酮-6-氨基己酸,中间体在过氧化氢的作用下，自动
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脱竣氧化为5AVA o最后一条途径是2-酮-6-氨基己酸介导的多基因合成5-氨基戊酸途径，这是一条非天然合成途径。

2.15-氨基戊酰胺介导合成5-氨基戊酸途径
5AVA的天然合成途径是在恶臭假单胞菌中发现的，其合成途径见图2。

首先,L-赖氨酸被L-赖氨酸2-单加氧酶(DavB)氧化脱竣为5-氨基戊酰胺。

然后,5-氨基戊酰胺被8-氨基戊酰胺酶(DavA)水解为5AVA。

Liu等⑴将DavB和DavA进行分离纯化,利用生物酶法生产了20.8g/L5AVA,得率为0.69g/g赖氨酸。

Wang等⑵利用全细胞催化技术，优化诱导时间、反应温度、反应时间和金属离子等，最终获得了240.7g/L5AVA,这是目前世界上报道的最高产量。

Li等⑶过量表达赖氨酸转运蛋白LysP和4-氨基丁酸转运蛋白PP2911,进一步强化了5AVA的转运。

Joo等⑷利用芒草水解液,成功制备了12.51g/L5AVA O
DavB
5•氨基戊酰胺235•氨基戊酸
图25-氨基戊酸生物合成途径一
2.2戊二胺介导合成5-氨基戊酸途径
Rohles等⑸建立了生产C5平台化学品5AVA 与戊二胺的耦合生产工艺，合成途径见图3,最优菌株能生产28g/L5AVA,最大生产率为0.9g/L/h o Jorge等⑹建立了一种戊二胺介导的5AVA合成途径,以戊二胺为中间体,赖氨酸脱竣酶(LdcC)、戊二胺转氨酶(PatA)和了-氨基丁醛脱氢酶(PatD)三步法合成5AVA的生物合成途径,以葡萄糖胺、木糖和阿拉伯糖为替代碳源，生产了5.1g/L5AVA o
L•赖氨酸戊二胺'5-氨基戊醛5•氨基戊酸
图35-氧基戊酸生物合成途径二
2.32-酮-6-氨基己酸介导单基因合成5-氨基戊酸途径
Pukin等⑺利用来源于绿色木霉的L-赖氨酸a-氧化酶(LysOx)将L-赖氨酸的a-氨基氧化成拨基，同时产生NH3和比02,生成的中间体2-酮-6氨基己酸在不添加过氧化氢酶的情况下自动氧化脱竣形成5AVA,利用固定化酶LysOx在37弋条件下反应5d后成功制备了13.4g/I5AVA o Cheng等⑻将日本鳍来源的L-赖氨酸a-氧化酶(RaiP)在大肠杆菌BI21 (DE3)中过量表达,敲除赖氨酸降解基因cadA以减少底物消耗，建立L-赖氨酸a-氧化酶单基因表达的代谢工程菌株。

添加4%乙醇和10mM H2O2能显著提高5AVA的产量，最后在5-L发酵罐中生产了
2021年第3期生杨技术29.12g/L5AVA,得率为0.44g/g赖氨酸。

马金莲等⑼发现L-氨基酸氧化酶可以催化L-氨基酸的氨基生成相应酮酸,并且成功将来源于红球菌的氨基酸氧化酶在大肠杆菌中表达，并首次用于生物催化合成5AVA。

结果表明催化合成5AVA时，最适底物L-赖氨酸浓度为17mmol/L,最适pH为7.0,最适温度为37戈，最适时间为24h,添加0.5% H2O2,最终5AVA产量达到16.71mmol/L0此研究成功实现了L-氨基酸氧化酶合成5AVA。

NH2O
H2N x^xx^'COOH，h2N xx^xx^z^COOH H z<^»
L-赖氮酸dNW+吨2-8B-6-氨基己嚴COa5-氮基戊酸
图45-氨基戊酸生物合成途径三
2.42-酮-6-氨基己酸介导多基因合成5-氨基戊酸途径
Cheng等皿首次建立了2-酮-6-氨基己酸介导的5AVA合成途径。

过量表达日本鳍来源的L -赖氨酸a-氧化酶(RaiP)、乳酸乳球菌来源的a -酮酸脱竣酶(KivD)和大肠杆菌来源的乙醛脱氢酶(PadA),在大肠杆菌中实现L-赖氨酸到5AVA 的生物合成。

通过过量表达过氧化氢酶KatE来分解RaiP产生的H202o利用同源性建模、分子对接和分子动力学模拟等方法识别突变位点，提出了一种可能的酶改造机制:突变体催化通道的扩大，更多氢键的形成，可能更有利于底物舒展。

使用了四种策略来增加5AVA的生产。

首先，赖氨酸脱竣酶基因cadA被敲除。

第二,L-赖氨酸盐酸盐被用作底物。

第三,比()2可以抑制细胞生长,从而影响目标生产。

因此通过过氧化氢酶KatE的表达,比()2被分解，含量显著降低。

此外，赖氨酸转运蛋白LysP 被过量表达，加强底物赖氨酸的转运。

最后通过分批补料生物转化得到52.24g/L5AVA o
图55-氨基戊酸生物合成途径四
3提高生物合成5-氨基戊酸产量的策略
培养基成分和培养条件对5AVA的生物合成有显著影响。

为提高5AVA生物合成的经济性，研究人员对菌种选育、培养基成分优化、发酵条件优化和蛋白表达优化等策略进行了广泛的研究。

虽然恶臭假单胞菌具有天然的5AVA合成途径，但发酵过程通常很长,这增加了设备成本,进一步限制了工业化的可扩展性。

因此，除了恶臭假单胞菌以外,大肠杆菌和枯草芽抱杆菌合成5AVA也取得了重大突破。

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生物技术2021年第3期8川恋业科41
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在工业发酵过程中,发酵培养基的成分对于代谢产物的产量和得率至关重要。

4结语和展望
由于化学合成工艺的缺陷，生物合成5AVA受到越来越多的关注。

虽然在机理认识和提高5AVA 产量和得率方面取得了很大突破，但在经济上仍不具备工业化的可行性。

为了将实验室研究成果转化为工业过程,底盘菌种开发和生物过程优化之间的深度集成综合开发是必要的。

综上，生物合成5AVA的方法主要有生物酶法、发酵法和全细胞催化法，每种方法各有优缺点。

目前有4种5AVA生物合成途径。

产量较高的是途径一：5-氨基戊酰胺介导合成5-氨基戊酸途径和途径四：2-酮-6-氨基己酸介导的多基因合成5-氨基戊酸途径，具有产业化前景。

生物酶法需要进一步优化生物合成途径,控制合成的关键步骤，定向进化合成关键酶，从而获得高纯度的5AVA；发酵法需要进一步改进发酵步骤,从而提高合成5AVA的效率;全细胞催化法需要进一步提高催化效率，提高细胞密度。

目前这些方法都处在实验室小试阶段,还未进行中试和产业化，还有待进一步研究改进。

5AVA是合成尼龙5和尼龙5,6的重要前体物质,如今工业生产5AVA污染比较大，并且生产效率不高，所以降低5AVA生产成本是可持续发展的重要研究方向,并且拥有巨大的发展前景。

随着生物科学技术的发展，生物法合成5AVA的研究也将不断改进，从而降低生产成本，提高产量。

表15-氨基戊酸的生物合成
合成途径宿主合成策略5AVA浓度(g/L)底物1大肠杆菌全细胞催化240.70L-赖氨酸1大肠杆菌酶法63.20L-赖氨酸1大肠杆菌酶法20.80L-赖氨酸1谷氨酸棒状杆菌分批补料发酵12.51芒草水解液1谷氨酸棒状杆菌分批补料发酵28.00葡萄糖2谷氨酸棒状杆菌发酵法 5.10葡萄糖和替代碳源3-酶法13.40L-赖氨酸3大肠杆菌全细胞催化29.12L_赖氨酸盐酸盐4大肠杆菌全细胞催化52.24L赖氨酸盐酸盐
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