高表达MAL62基因对面包酵母耐高糖的影响

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㊀2021Vol.47No.1(Total 421)
DOI:10.13995/ki.11-1802/ts.025066
引用格式:孙溪,刘海晴,张军,等.高表达MAL 62基因对面包酵母耐高糖的影响[J].食品与发酵工业,2021,47(1):8-13.
SUN Xi,LIU Haiqing,ZHANG Jun,et al.Overexpression of MAL 62increased sugar tolerance of baker s yeast[J].Food and Fermentation Industries,2021,47(1):8-13.
高表达MAL 62基因对面包酵母耐高糖的影响
孙溪1,2∗,刘海晴1,2,张军1,2,范志华1,2,黄亮3
1(天津农学院食品与生物工程学院,天津,300384)2(天津市农副产品深加工技术工程中心,天津,300384)
3(天津农学院农学与资源环境学院,天津,300384)
摘㊀要㊀面包酵母(Saccharomyces cerevisiae)的抗逆性对于烘焙工业至关重要㊂以前期获得的耐冷冻酵母突变株B +MAL62为研究对象,测定其在高糖环境下的生长特性㊁形态特征㊁胞内海藻糖与甘油的积累以及产气的变化,并与市售高糖酵母进行对比㊂研究发现在质量分数为40%~60%的糖胁迫环境下,B +MAL62菌株的胞内海藻糖与甘油水平分别比对照菌株提升55.03%~64.27%与1.2~1.3倍,且高糖环境下B +MAL62具有更好的细胞形态稳定性,其产气速度以及最终产气量可优于市售高糖酵母㊂结果表明,麦芽糖酶编码基因MAL 62高表达可增强面包酵母耐高糖能力㊂
关键词㊀面包酵母;海藻糖;甘油;麦芽糖酶;产气
第一作者:博士,讲师(通讯作者,E-mail:sunxi@)
基金项目:国家自然科学基金项目(31701569);天津市青年拔尖人才项目(TJTZJH-QNBJRC-1-19)收稿日期:2020-07-15,改回日期:2020-08-12
㊀㊀面包工业中常常使用含糖面团来制作甜面包,但
高浓度的糖分会引发高渗胁迫,导致胞内水分外迁,扰乱并破坏细胞质膜上的离子梯度和细胞抵御能力,并最终使细胞破裂死亡[1]㊂为应对此种情况,酵母细胞通常会富集甘油㊁海藻糖㊁氨基酸等物质来抵御高渗胁迫引起的细胞损伤,提高菌株抗性[2]㊂
酵母菌能够利用麦芽糖与MAL 基因座(MAL 1~
4和MAL 6)有关,每个MAL 基因座均包含编码麦芽糖运输蛋白的MALx 1(又名MALxT ),x 代表基因座位置,编码麦芽糖酶的MALx 2(又名MALxS ),以及编码正调节蛋白的MALx 3(又名MALxR ),其中麦芽糖酶是麦芽糖水解的关键酶[3]㊂在之前的试验中发现,工业酵母BY14a 中高表达麦芽糖酶编码基因MAL 62,会提高突变株B +MAL62的胞内海藻糖含量,增强突变株耐冷冻能力[4]㊂海藻糖是一种非还原性的葡二聚糖,随着外界生存压力的增强,其在胞内的含量会随之上升[5]㊂BELL 等[6]发现,酵母在面临渗透压胁迫时,野生菌株比无法合成海藻糖的突变株(TPS 1Δ㊁TPS 2Δ)生存率更高㊂STAMBUK 等[7]和JULES 等[8]等研究发现,酵母从胞外向胞内转运海藻糖时,菌株自身的麦芽糖代谢状态会对这个过程有所影响,只有组成型表达的MAL 基因座才能够开启Agt1p 的海藻糖转运功能㊂
目前有关菌体耐胁迫受麦芽糖代谢调控的相关研究仅集中在完整的MAL 基因座上,针对单独的麦芽糖酶与胞内海藻糖含量以及酵母耐高渗能力之间的联系并无报道㊂由于海藻糖具有保护胞内可溶性酶和细胞膜稳定性的功能[9],因此,猜测MAL 62基因的高表达可能会使突变株在耐冷冻以外获得一定程度的耐高渗能力㊂鉴于此,本课题计划探究麦芽糖酶编码基因MAL 62高表达对菌株的生长特性㊁形态特征㊁胞内应激物质积累及产气在不同糖浓度环境下所带来的影响,并与市售高糖酵母进行对比,初步探索相关现象出现的可能原因,为挖掘面包酵母麦芽糖酶多抗性奠定良好基础㊂
1㊀材料与方法
1.1㊀菌种及培养基
酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae )BY14a,天津科技大学张翠英教授惠赠;突变株B +MAL62及市售高糖活性干酵母GSJ 与GML,保存于天津农学院发酵与酿造食品实验室㊂
酵母浸出粉胨葡萄糖(yeast extract peptone dex-trose,YEPD)培养基:葡萄糖2%,蛋白胨2%,酵母浸粉1%,固体YEPD 添加琼脂2%㊂LSMLD 培养基:液体模拟面团培养基,其配方参考文献[10]㊂高糖培养
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㊀基:在LSMLD 培养基基础上,将葡萄糖质量分数替换为40%㊁50%与60%㊂培养基均需121ħ灭菌20min㊂1.2㊀主要试剂与设备
葡萄糖㊁酵母浸粉和琼脂粉,北京奥博星生物技术有限公司;蛋白胨,天津市英博生化试剂有限公司;海藻糖标准品(分析纯99%),Sigma 公司;丙三醇(分析纯),天津试剂厂;甘油检测试剂盒,Megazyme 公司;高筋小麦粉,五得利金富强;其他未注明试剂均为分析纯,国药化学试剂公司㊂
恒温培养箱(DHP-420BS),天津市中环电炉有限公司;立式摇床(HNY-2102C),天津欧诺仪器股份有限公司;移液器(Research plus),Effendorf 公司;高速冷冻离心机(gL20A),中科院生物物理所技术服务公司;离子溅射仪(SD-3000),北京博远微纳科技有限公司;台式扫描电子显微镜(Phenom pro),荷兰飞纳公司㊂1.3㊀实验方法1.3.1㊀菌种培养条件
挑取1环菌泥接入5mL YEPD 培养基中,28ħ㊁
180r /min 振荡24h,以1%接种量转入高糖LSMLD 培养基中,30ħ,180r /min 振荡培养相应时间㊂1.3.2㊀海藻糖与甘油检测方法
取适量菌体,双蒸水洗涤2次㊂胞内海藻糖测定
采用硫酸蒽酮法[11],甘油含量的测定采用Megazyme 甘油检测试剂盒[12],实验重复3次取平均值㊂
1.3.3㊀生长性能测定
菌体在高糖培养基中30ħ,180r /min 振荡培养
64h,每隔2h 取样,双蒸水洗涤2次后测定OD 600,以空白培养基作为对照,绘制生长曲线,实验重复3次取平均值㊂
1.3.4㊀细胞形态观察
菌体在高糖培养基中培养至对数期,双蒸水洗涤
菌体2次,立即涂布于导电胶,真空喷金,台式扫描电镜观察㊂
1.3.5㊀产气性能测定
杜氏产气:每5mL 高糖培养基中接入1mL 种子
液,30ħ,间隔12h 观察杜氏小管中产气量㊂分为0~5等级:0级,管内无气体;1级至5级分别为管内1/8㊁1/4㊁1/2㊁3/4及满气㊂结果取3次实验平均值㊂
实际产气实验:采用量筒法进行实际产气实验[13],含糖面团[14]于30ħ条件下间隔30min 记录体积,结果取3次实验平均值㊂1.3.6㊀数据统计方法
采用ANOVA 法统计菌株间差异,t -检验法统计
突变株与出发菌株的差异,P <0.05为显著,P <0.01为极显著㊂
2㊀结果与分析
2.1㊀胞内物质含量
各菌株胞内海藻糖含量如图1所示,40%糖胁迫环境下,B +MAL62胞内海藻糖含量为51.15mg /g,比BY14a 高出64.27%(P <0.05);当糖质量分数由50%升至60%时,B +MAL62的胞内海藻糖则可分别比BY14a 提高55.03%与59.06%(P <0.05)㊂但与市售高糖菌株相比,B +MAL62的优势则不明显,当胁迫糖的质量分数由40%提至60%时,B +MAL62的胞内海藻糖仅仅比市售高糖酵母的平均值高出12.26%㊁12.44%
和12.74%㊂因此,尽管高表达MAL 62基因能够明显提升出发菌株的胞内海藻糖含量,但仅能够达到与市售高糖酵母相近的水平㊂
图1㊀高糖环境下各菌株的胞内海藻糖含量Fig.1㊀Contents of intracellular trehalose of the four strains
under high sugar stress
各菌株胞内甘油含量如图2所示,当胁迫糖的质量分数为40%时,B +MAL62的胞内甘油含量为17.41μg /mg,为BY14a 时的2.30倍;当糖的质量分数升至50%与60%时,则分别为2.20与2.24倍(P <0.01)㊂与市售高糖菌株相比,B +MAL62的胞内甘油水平亦具有优势㊂当糖的质量分数由40%升至60%时,B +MAL62的胞内甘油可以比市售高糖酵母的平均值高出27.10%㊁29.90%和28.45%(P <0.05)㊂因此,高表达MAL 62基因能够明显提升出发菌株的胞内甘油含量,并使其高于市售高糖酵母的平均水平㊂
通过实验发现,随着糖浓度升高,各菌株胞内海藻糖及甘油的含量均呈现升高趋势㊂其中B +MAL62菌株随着渗透压升高,胞内甘油提升速率较大,达到26.04%,其胞内海藻糖含量的提升速率也可达到11.11%㊂有报道称,海藻糖合成基因TPS 1㊁
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TPS 2以及甘油合成关键基因GDP 1的启动子上均带有STREs 序列[15-16],在许多胁迫基因的启动子上,
Msn2p㊁Msn4p 与STREs 绑定[17],且Msn2p㊁Msn4p 是Hog1实现高渗透压胁迫下控制基因表达的重要转录激活因子[18]㊂因此,由实验结果进行推测,MAL 62基因的高表达可能通过影响Hog1㊁Msn2㊁Msn4通路,激活了TPS 1㊁TPS 2以及GDP 1共同的STRE 压力响应元件;同时,MAL 62基因高表达引发了麦芽糖酶水平提高[19],很可能导致胞内葡萄糖等底物水平提高,致使海藻糖和甘油合成前体水平提高[20],
由此提升了菌株胞内海藻糖及甘油的含量㊂后期将进一步使用多组学方法分析并协通相关发酵实验验证上述内容,
相关实验正在进行中㊂
图2㊀高糖环境下各菌株的胞内甘油含量Fig.2㊀Contents of intracellular glycerol of the four
strains under high sugar stress
2.2㊀菌株生长性能的比较
由图3可知,当胁迫糖的质量分数为40%时,B +MAL62菌株的停滞期为6h,是BY14a 的一半,与市售高糖菌株GSJ 及GML 的平均停滞期相近㊂当胁迫糖的质量分数为50%时,B +MAL62比对照BY14a 停滞期减少50%,与市售高糖GML 相近㊂总的来看,随着糖浓度的增加,各菌株的延滞期也随之增长,发酵至55h 后,所有菌株的OD 600值均无明显续增,甚至还会出现下降㊂这也许是因为高渗环境会造成细胞严重脱水进而使细胞失活[21],或者由于在高糖胁迫下,酵母细胞内会产生过量的活性氧和活性氮等有害物质,促使线粒体产生超氧化物并激活一氧化氮合酶,形成过氧亚硝基,致使机体进一步被氧化而受损伤,甚至凋亡[22]㊂在高渗环境下,酵母会通过合成甘油与海藻糖平衡胞内渗透压以防止细胞脱水[23-25]㊂实验发现B +MAL62的胞内甘油与海藻糖快速增加,说明B +MAL62菌株可以获得更多的胞内保护物质,这可以
解释为何B +MAL62菌株能够在高糖环境下比对照菌更早进入对数期㊂图3㊀高糖环境下各菌株的生长曲线
Fig.3㊀Growth curve of the four strains under high sugar stress
2.3㊀菌株细胞形态观察
由图4-a 和图4-d 可知,质量分数为40%糖胁迫时,市售高糖酵母GSJ 与GML 的细胞均出现不同程度的凹陷(箭头处),BY14a 菌株(图4-g)细胞表面出现部分褶皱,B +MAL62菌株(图4-j)细胞呈椭球形,表面光滑,均匀,个体独立㊂质量分数为50%糖胁迫时,GSJ 和GML(图4-b 和4-e)的细胞表面已经出现大量凹陷甚至部分塌陷(箭头处),BY14a(图4-h)也呈现出结构塌陷(箭头处),B
+MAL62(图4-k)失去平滑的外观,出现凹凸不平(箭头处)㊂
a-GSJ 40%;b-GSJ 50%;c-GSJ 60%;d-GML 40%;e-GML 50%;f-GML 60%;g-BY14a 40%;h-BY14a 50%;i-BY14a 60%;j-B +MAL6240%;k-B +MAL6250%;l-B +MAL6260%
图4㊀高糖环境下各菌株的细胞形貌
Fig.4㊀Cell morphology of the four strains under high
sugar stress
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㊀随着胁迫糖的质量分数升高至60%,GSJ 和GML(图4-c 与4-f)的菌体严重坍塌,细胞壁破损,出现破碎组织;BY14a(图4-i)的菌体也呈现塌陷与空洞(箭头处),B +MAL62(图4-l)则皱缩严重,出现细胞黏连及部分塌陷(箭头处)㊂据报道,高渗环境会影响面包酵母的糖酵解,糖异生㊁脂肪酸合成㊁细胞膜内的酶活性,这些代谢反应变化与面包酵母形态的改变有关[26]㊂此外,高渗环境下HOG 途径所涉及的压力响应途径与细胞壁完整性途径存在协作关系,细胞壁损伤会同时激活上述2个途径,使之一同调控酵母细胞壁有关葡聚糖形成的基因转录[27]㊂由于B +MAL62菌株胞内甘油含量提升,因此我们推测也许MAL 62基因高表达会通过上述途径增强细胞壁的稳定性,进而减少高糖环境下B +MAL62菌株的破碎死亡率㊂2.4㊀菌株产气性能比较
由图5可见,质量分数为40%与50%糖胁迫时,GSJ 与GML 菌株直至发酵18h 时杜氏产气等级仍大多处于2级(50%糖的GML 菌株除外);相比之下,B +MAL62菌株在糖质量分数为40%与50%时发酵12h 即可达到杜氏产气3级,说明40%~50%糖环境下B +MAL62菌株的起始产气能力大于GSJ㊁GML 以及BY14a 菌株㊂但是,当糖胁迫的质量分数升至60%时,B +MAL62
菌株的快速产气能力受到抑制,各阶段产气量与GSJ 与GML 菌株近似,失去了产气速度的优势㊂
图5㊀高糖环境下各菌株的杜氏小管产气Fig.5㊀Gas production of the four strains in Durham s
fermentation tube under high sugar stress
㊀㊀为了进一步对比各菌株的实际产气能力,采用量筒法检测了4种酵母在实际含糖面团中的发酵力,结果如图6所示㊂几个时间点内,B +MAL62菌株的产气量几乎均为最大,在发酵末期可达到84mL,分别高出GSJ㊁GML 与BY14a 35.48%㊁6.33%和21.74%㊂从产气速度来看,3h 内B +MAL62菌株增长了66mL,可分别高出其他菌株50.00%(GSJ),
4.76%(GML)与34.69%(BY14a)㊂
图6㊀高糖环境下各菌株的实际面团产气
Fig.6㊀Gas production of the four strains in high sugar dough
有报道认为,酵母菌自身的甘油合成能力以及胞内海藻糖含量与菌株发酵力具有明显的相关性[25,28],此外,实际面团发酵初期,菌体的抗压反应机制会被迅速激活,HOG 途径相关的基因表达会剧烈变化[29],由于HOG 途径与甘油等相关保护性物质关系密切,这意味着较高的胞内甘油含量可以更好地抵御实际面团发酵初期的各种胁迫,此外,胞内甘油还能够明显促进面团的持气能力[24]㊂因此,具有较多胞内甘油和海藻糖的B +MAL62菌株可以更好地应对高糖面团发酵开始阶段的低水活压力,并最终在实际面团产气方面体现出优势㊂
3㊀结论
基于前期研究基础,本课题针对高表达麦芽糖酶基因MAL 62的耐冷冻突变株B +MAL62进行了抗高糖方面的研究㊂发现质量分数为40%~60%的糖胁迫下,MAL 62高表达能够将酵母胞内海藻糖与甘油的含量分别提升23.42%~30.78%与0.88~0.96倍;并可以在高糖环境下更好地保持细胞形态的稳定性㊂通过对B +MAL62菌株进行产气测试发现,高糖环境下其产气速度及最终产气量均优于出发菌株,甚至优于市售高糖酵母㊂本研究为进一步探究酵母的多抗性提供了重要技术参考㊂
参
考
文
献
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Overexpression of MAL62increased sugar tolerance of baker s yeast
SUN Xi1,2∗,LIU Haiqing1,2,ZHANG Jun1,2,FAN Zhihua1,2,HUANG Liang3 1(College of Biological Engineering,Tianjin Agricultural University,Tianjin300384,China)
2(Tianjin Engineering Research Center of Agricultural Products Processing,Tianjin300384,China)
3(College of Agronomy and Resource Environment,Tianjin Agricultural University,Tianjin300384,China) ABSTRACT㊀Stress tolerance of baker s yeast(Saccharomyces cerevisiae)is critical to the baking industry.In this study,the high sug-ar tolerance of cryotolerant yeast B+MAL62obtained previously was determined and its growth characteristics,morphological stability,in-tracellular trehalose and glycerol content and gas production under high sugar stress were tested and compared with the commercially high-sugar tolerant yeast.Results showed that compared with the control strain,at40%-60%sugar stress,the intracellular trehalose and glycerol levels in B+MAL62strain were increased by55.03%-64.27%and1.2-1.3times,respectively.Moreover,its morphologi-cal stability,gas production rate and final gas production in high sugar stress were better than the control strain and the commercial sugar-tolerance yeast.These results showed that overexpression of MAL62could improve the sugar tolerance of baker's yeast.The study reveals a new way of enhancing multi-tolerance of baker s yeast and improving the knowledge of how the maltose metabolism affects the multi-tol-erance of baker s yeast.This study provides a valuable insight into breeding of novel multi-resistant baker's yeast strains and a better un-derstanding of other sugar metabolism,which has the potential to promote the technological level of yeast industry.
Key words㊀baker s yeast;trehalose;glycerol;maltase;gas production
2021年第47卷第1期(总第421期)13
㊀。