有机染料的吸附柱色谱

柱色谱分离示意图
色谱分离效果与固定相的颗粒直径大小、含 水量有关，也与流动相和被分离物质的极性的间的关系如图所示。
样品极性吸附剂活性和洗脱剂极性三者关系图
氧化铝是一种极性吸附剂，对极性较强的物质的 吸附力强；对极性较弱的物质的吸附力较弱。氧化铝 和硅胶的活性与含水量有关。一般分离用2级活性的吸 附剂。
二实验原理分类方法色谱类型分离原理分离原理吸附色谱分配色谱凝吸附色谱分配色谱凝胶色谱离子交换色谱固定相和流动相状态气相色谱液相色谱固定相所处的状态柱色谱薄层色谱纸色谱吸附柱色谱是利用装在柱中的经过活化的多孔性或粉状固体吸附剂常用的吸附剂有氧化铝硅胶等在色谱分离中称固定相对待分离混合物中各组分的吸附能力的不同及各组分在洗脱剂中的溶解性能不同进行分离的
七、思考题
1、若色谱柱装填不紧密均匀，对分离结果又和影响？ 如何避免？ 2、为什么极性大的组分要用极性大的溶剂洗脱？ 3、根据本实验的分离结果，判断甲基橙和亚甲基兰的 极性大小？ 4、在氧化铝柱子上分别分离下列两组混合物时，哪一 个组分先被洗脱下来? （1）邻硝基苯胺和对邻硝基苯胺 （2）偶氮苯和4-苯偶氮苯偶氮-2-萘酚（苏丹III）
HO
－N＝N－
－N＝N－
－N＝N－
5、在回收率测定时，需配制有机染料混合溶液，为什 么要用0.1mol· L-1HCl溶液定容？ 6、根据实验结果，分析影响两种染料回收率不同的原因。
八、作业
撰写实验报告。 回答思考题1、2、4、5。 预习“合成制取甲基橙”实验，冰水 浴操作。 阅读实验指导书P52～54和 《有机化学》含氮化合物中的伯胺的 性质的内容。
2、洗脱分离
当柱中流动相下降到滤纸片 上端1mm时，立即小心地滴加入 吸量管中的0.50mL有机染料混合 溶液，待混合溶液液面下降到将 与滤纸片相平时，用少量95％乙 醇将色谱柱内壁沾附的混合溶液 淋洗入柱内，然后少量多次地加 入95％乙醇洗脱，用25mL容量瓶 接收第一种染料洗脱分离液；再 改用0.1 mol· L-1HCl溶液继续洗 脱，用另一个25mL容量瓶接受第 二种染料洗脱分离液。
操作注意事项
1、避免液态物质加入时冲击吸附剂表面引起柱 内各处洗脱剂移动速度不同。 2、试样溶液应在固定相上面小心加入，避免溅 到色谱柱内壁或在内壁沾附太多；沾附在色谱柱内 壁上的试样溶液需用少量洗脱剂淋洗，使试样液全 部进入固定相中。 3、应控制柱分离的洗脱速度，本实验中不能采 用洗耳球加压的方法来加快洗脱速度。 4、需计算有机染料的色谱分离回收率，应准确 加入试样溶液的定容。
材料：
脱脂棉，擦镜纸，滤纸片。
四、实验步骤
1、装柱
将少许脱脂棉放到洁净的色谱柱底部，用玻璃帮 轻压使平 ( 本实验室使用的色谱柱底部已烧结有砂芯 板，不需再放脱脂棉 ) ，通过干燥的小漏斗少量多次 地加入氧化铝，加入氧化铝的同时用玻璃棒轻敲色谱 柱，使氧化铝装填均匀，松紧适当，直到色谱柱内氧 化铝粉末高度在6～8cm，在氧化铝表面放上2片滤纸 片。打开色谱柱底部的活塞，然后加入95％乙醇（流 动相），使液体下滴速度为 1 滴 /s ，用小烧杯在色谱 柱下承接，至柱内的氧化铝全部被润湿。 注意：从加入乙醇起，柱子上端的氧化铝不能被 暴露在空气中。
一、实验目的
1、学习柱色谱分离的基本原理。 2、学习和掌握柱色谱的操作方法。 3、测定柱色谱分离回收率。
二、实验原理
色谱法又称层析法，色谱分离是物理化学分离 方法，本实验是以氧化铝为吸附剂的柱色谱。 分类方法 色谱类型
分离原理
吸附色谱，分配色谱，凝 胶色谱，离子交换色谱
柱色谱，薄层色谱，纸色 谱
固定相和流动相状态 气相色谱，液相色谱 固定相所处的状态
吸附柱色谱是利用装在柱中的经过活化的多孔性 或粉状固体吸附剂（常用的吸附剂 有氧化铝、硅胶等， 在色谱分离中称固定相）对待分离混合物中各组分的 吸附能力的不同及各组分在洗脱剂中的溶解性能不同 进行分离的。当混合物溶液流过吸附柱时，各组分同 时被吸附在柱的上端，然后从柱顶不断加入溶剂（洗 脱剂，称流动相）洗脱。由于不同化合物极性不同， 被吸附能力不同，随着溶剂下移的速度不同，于是混 合物中各组分按吸附剂对它们所吸附的强弱顺序在柱 中自上而下形成了若干色带。经过适当时间移动后， 各种组分就可以完全分开，继续用溶剂洗脱，吸附能 力最弱的组分随洗脱剂首先流出，再继续加洗脱剂可 将各组分依次全部从柱中洗脱出来，分别收集各组分。 测量有色组分的吸光度即可计算回收率。
五、实验关键
1、装柱要紧密，要求无断层、无缝隙、柱顶 面装填平整、柱身安装要垂直。 2、从润洗柱身开始导分离结束的整个过程 中，始终保持有溶剂覆盖吸附剂。 3、洗脱剂应少量多次加入，维持一定的压力 差，加入的洗脱剂将压实吸附剂，洗脱速度减 慢。 4、洗脱分离液应全部收集，二种色带的洗脱 液不要被交叉收集。 5、试样溶液应准确移取。 6、应使用同一套比色皿测量溶液吸光度，改 变入射光波长λ，需重新调整透光度0和100％。
色谱柱可有干法和湿法两种装柱方法。 干法装柱的方法是：在干净的色谱柱底部塞少量脱脂棉 （或玻璃棉）使平整，再放一片与柱内径相当的滤纸，关闭 活塞，从干漏斗分批加入固定相（载体），边装边轻轻敲击 柱子，使装填紧密均匀并到适宜高度，再在柱顶部放上2片 与柱内径相当的滤纸，打开活塞，加入适宜溶剂润湿柱身。 湿法装柱的方法是：在干净的色谱柱底部塞少量脱脂棉 （或玻璃棉）使平整，再放一片与柱内径相当的滤纸，关闭 活塞，加入适宜溶剂至柱高度的一半，将调成悬浊液的固定 相不断慢慢地倒入柱内，同时需打开活塞，使溶剂慢慢流出 （液体下滴速度为每秒1滴），直到固定相的沉降不再变动 为止，然后在柱顶部放上2片与柱内径相当的滤纸。
3、回收率测定
将分离出的亚甲基蓝溶液用95％乙醇定容，甲 基橙溶液用0.1mol· L-1HCl溶液定容，分别以蒸馏水 为参比，在450nm处测定甲基橙溶液的吸光度A1， 在661nm处测定亚甲基兰溶液的吸光度A2。 准确移取0.50mL有机染料混合溶液于25mL容 量瓶，用0.1mol· L-1HCl溶液定容，分别测定在450 nm和661nm处的吸光度A1′和A2′，按η1=A1/A1′ 和η2=A2/A2′计算各组分的回收率。
三、实验仪器与试剂
仪器：
具塞色谱柱(10cm×1cm)1支，容量瓶(25mL)3个，烧杯 (50mL)1个，吸量管(1mL)1支，玻璃棒1根，滴定台带滴定管 夹，滴管1个，小漏斗1个， 722光栅型分光光度计，小剪刀 (共用)。
试剂：
色谱用中性氧化铝，95％乙醇，0.1mol· L-1HCl溶液, 0.1g· L1甲基橙和0.1g· L-1亚甲基兰乙醇溶液(H2O∶95％乙 醇=1∶1)。
吸附剂的含水量和活性等级关系
活性等级
氧化铝含水量 硅胶含水量
Ⅰ 0 0
Ⅱ 3% 5%
Ⅲ 6% 15%
Ⅳ 10% 25%
Ⅴ 15% 38%
当被分离样品和固定相活性等条件一定时，采用洗脱剂的极 性逐渐递增的次序来选用洗脱剂。常用洗脱剂的极性（洗脱能力） 递增的次序为： 己烷和石油醚＜环己烷＜四氯化碳＜三氯乙烯＜二硫化碳＜甲苯 ＜苯＜二氯甲烷＜氯仿＜乙醚＜乙酸乙酯＜丙酮＜乙醇＜甲醇＜ 水＜吡啶＜乙酸＜酸碱溶液