贵州茂兰自然保护区子囊菌真菌的多样性

贵州茂兰自然保护区子囊菌真菌的多样性
任军;揭春玉;曾琛;姜于兰;王勇;Kevin D. Hyde
【摘要】To know the ecosystem, enrich fungal diversity and preferably preserve microbial community diversity of Maolan Nature Reserve, in 2012, the ascomycota fungal diversity of Maolan Nature Reserve was investigated, 110 specimens were collected and identified by combining morphological characteristics with molecular characteristics. The results showed that that the fungi mainly belonged to Dothideomycetes and Sordariomycetes, including 8 families, 11 genera, 12 species.%为了解茂兰自然保护区的生态系统,丰富自然保护区真菌种类资源,更好地保护该区微生物多样性群落,2012年调查了茂兰自然保护区子囊菌亚门真菌的多样性,采用形态学特征与分子学特征相结合的鉴定方法,对采集的110份真菌标本进行鉴定.结果表明,样品中真菌主要隶属于座囊菌纲与粪壳菌纲,共8科,11属,12种.
【期刊名称】《贵州农业科学》
【年(卷),期】2013(041)001
【总页数】6页(P95-100)
【关键词】子囊菌亚门;形态学;分子学
【作者】任军;揭春玉;曾琛;姜于兰;王勇;Kevin D. Hyde
【作者单位】贵州大学农学院,贵州贵阳550025;贵州大学农学院,贵州贵阳550025;贵州大学农学院,贵州贵阳550025;贵州大学农学院,贵州贵阳550025;贵
州大学农学院,贵州贵阳550025;School of Science, Mae Fah Luang University, Chiang Rai, Thailand
【正文语种】中文
【中图分类】S759.9
贵州茂兰国家级自然保护区地处云贵高原向广西丘陵盆地过渡的斜坡地带上，位于荔波县的东南部，面积7万hm2，因地处中亚热带南缘，加之喀斯特地貌生境复杂多样，森林生态空间广阔，是至今保存着的世界上面积最大的喀斯特原始森林。

该地区的特殊气候条件为动植物以及微生物提供了良好的生存环境，蕴含着丰富的动植物种类及遗传种质资源，过去对该地区的植物[1-2]、动物[3]、昆虫[4-5]、微生物[6]都已有报道，大型真菌报道较多，然而对该地区子囊菌亚门真菌资源研究较少。

为全面了解茂兰国家级自然保护区真菌资源情况，笔者于2012年参考真菌种类和分类系统[7-10]等资料，对该自然保护区的子囊菌亚门真菌多样性进行初步调查，旨在更好地了解该自然保护区的生态系统，为该区的生态保护提供参考。

1 调查研究方法
1.1 调查材料的采集地
2012年5月对茂兰自然保护区子囊菌亚门真菌进行了实地调查，并采集标本110份，将采集的标本放置于牛皮纸信封中带回实验室进行分离鉴定。

调查时主要针对森林中的树桩、落叶、竹子、植物发病叶片以及溪水旁枯木进行标本采集。

1.2 鉴定方法
1.2.1 形态学鉴定依据采集标本所拍的实物照片及镜检特征进行鉴定，首先利用奥特SZ660解剖镜对寄主上的真菌子囊果进行观察，记录其颜色、形状；其次利用奥林巴斯CX21显微镜对子囊、孢子的颜色、形状进行观察；最后将采集到的真菌
子囊及孢子制成永久玻片，采用Nikon ECLIPSE 80i显微镜对玻片照相以及测量子囊、孢子大小；综合子囊果、子囊和孢子的形状、大小、颜色等对采集到的真菌进行初步分类。

1.2.2 分子学鉴定采用单孢分离方法将采集的菌株标本纯化培养，在PDA培养基上无光照培养30 d，培养箱温度控制在28℃。

无菌操作刮取少量菌丝，利用试剂盒Biomiga EZgeneTM Fungal gDNA Miniprep Kit (Biomiga, Inc, San Diego, USA) 提取菌株DNA，应用大亚基(LSU)区段引物(LROR/LR5)和小亚基(SSU)区段引物(NS1/NS4)对菌株rDNA分别进行PCR扩增[11]，扩增产物通过琼脂糖凝胶电泳检测后送至北京诺赛公司测序。

将测序结果同Genbank上的基因序列比对，进一步鉴定各个菌株的分类地位，结合分子学鉴定结果更加完善其分类地位。

表茂兰自然保护区子囊菌真菌名录Table The ascomycota list of Maolan Nature Reserve科Family属Genus种Species黑球腔菌科Melanommataceae星裂球腔菌属Astrosphaeriella放射星裂球腔菌Astrosphaeriellastellata麻球腔菌属Byssosphaeria施氏麻球腔菌Byssosphaeriaschiedermayeriana多孢菌科Pleosporaceae匍柄霉属StemphyliumAnteagloniumparvulum茎点霉属PhomaPhomamacrostomaPhomaexigua扁孔腔菌科Lophiostomataceae扁孔腔菌属LophiostomaLophiostomamacrostomum暗球腔菌科Phaeosphaeriaceae球腔菌属PhaeosphaeriaPhaeosphaeriaavenaria纵裂菌科HysteriaceaeRhytidhysteronRhytidhysteronrufulum葡萄座腔菌科Botryosphaeriaceae葡萄座腔菌属BotryosphaeriaBotryosphaeriadothideaLasiodiplodiaLasiodiplodiapseudoth eobromae黑盘孢科AmphisphaeriaceaePestalotiopsisPestalotiopsisfoedansMitosporicXylariales
MicrodochiumMicrodochiumsp
2 结果与分析
2.1 种类名录
通过形态学特征与分子学特征相结合的方法初步鉴定采集真菌样本，结果表明，茂兰自然保护区采集的真菌主要隶属于座囊菌纲与粪壳菌纲，共8科，11属，12种。

依据Kirk(2008年)分类系统[13]编写了该自然保护区的子囊菌亚门真菌名录(表)。

2.2 形态学描述
2.2.1 Rhytidhysteron rufulum 多生长于腐木表面，子囊果较大，形状多数如船状，中间有一道裂缝(图版1A-b)，长2.5～4.5 mm，宽700～900 μm，单生或
簇生，黑色，子囊果壁炭化；子囊(190～225) μm×(13～18)μm(M=205 μm×15 μm,n=20)，棍棒状，子囊间有大量侧丝，子囊壁双层壁，具短柄；子囊孢子(28.6～33)μm×(8.6～11.5)μm(M=30.5 μm×10 μm,n=20)，8个孢子有序排列，成熟孢子黑褐色，椭圆形，两末端稍微弯曲，3隔膜，表面光滑(图版1A)。

2.2.2 Phoma exigua 生长在植物叶片上，多引起植物病害，子囊果很小，圆球状，半埋生于叶片组织内，直径为(85～110)μm，单生，黑褐色；子囊(52～
64)μm×(7～9)μm(M=56 μm×8 μm,n=20)，圆柱状，子囊间有大量侧丝，子囊壁双层壁，几乎不具有柄；子囊孢子(10～13.5)μm×(2.8～4.6)μm(M=12
μm×3.8 μm,n=20)，8个孢子有序排列于子囊中，孢子无色，纺锤形，两端微微
弯曲，1隔膜，表面光滑(图版1B)。

2.2.3 Lophiostoma macrostomum 生长在植物叶片上，子囊果很小(图版1C-c)，黑色，球状，直径150～200 μm，单生或偶尔簇生，子囊果壁厚度25～40
μm(图版1C-d、e)，子囊(75～85)μm×(9.5～11.5)μm(M=81.5 μm×10.5
μm,n=20)，似棍棒状，双层壁，具有分叉的短柄，柄长6～11 μm，子囊顶部有可见的小室(图版1C-h)；子囊孢子(22.5～26)μm×(4.5～5.5)μm(M=24 μm×5
μm,n=20)，8个孢子有序排列于子囊中，偶尔形成两列，孢子无色，纺锤形，两
端尖锐并具有附属物，略弯曲，孢子具一隔膜，表面多数有6个油滴，孢子成熟
后油滴消失，颜色变为褐色(图版1C)。

2.2.4 Phaeosphaeria avenaria 生长于竹枝表面，埋生于组织里，并将组织顶裂，与植物组织形成子囊果壁，子囊果黑色，无具体形状；子囊(51～74)μm×(7～
8.5)μm(M=64 μm×8 μm,n=20)，似棍棒状，无短柄，子囊孢子(36.5～
44.5)μm×(3～5)μm(M=41 μm×3.8 μm,n=20)，8个孢子有序排列于子囊中，
无色，棍状，两端尖锐，孢子略弯曲，无隔膜，表面多有6～8油滴(图版1D)。

2.2.5 Lasiodiplodia pseudotheobromae 图版2A为该菌株无性阶段，多生于植物叶片，引起植物病害，为植物重要的病原菌，分生孢子器埋生在叶片组织内，微突起，单生或簇生，黑色；分生孢子梗较短，长度12.5～15.7 μm，孢子顶生(图
版2A-d)；分生孢子(24～27)μm×(11～14.5)μm(M=26 μm×12.6 μm,n=20)，
卵圆形，孢子壁较厚，无色，无隔。

2.2.6 Botryosphaeria dothidea 图版2B为该菌株无性阶段，生于植物叶片，分
生孢子器埋生在组织内，与Lasiodiplodia pseudotheobromae隶属于同一科，分生孢子器黑色，球状，直径160～185 μm，与植物叶片组织结合形成分生孢子器壁，壁部细胞结构多数由2～3个细胞组成，呈长方形，褐色(图2B-d)；分生孢子(18.5～23.5)μm×(4.5～6.7)μm(M=21 μm×5 μm,n=20)，孢子杆状，一端圆钝，一端渐细，无色，无隔，表面光滑。

2.2.7 Microdochium phragmitis 该菌株属粪壳菌纲真菌，子囊果生长在竹子叶
片表面，使叶片干枯以致脱落，子囊果单生，黑色；子囊(90～105)μm×(7.5～10)μm(M=96 μm×8.5 μm,n=20)，棍棒状，单层壁，子囊间有大量侧丝，无色；孢子(13～16.5)μm×(3.7～5.5)μm(M=14.3 μm×4.5 μm，n=20)，8个孢子有序排列于子囊，椭圆形，无色，无隔膜，孢子表面偶尔具有油滴(图版2C)。

2.2.8 Pestalotiopsis foedans 属粪壳菌纲真菌，生长于竹子茎部，子囊果埋生在组织内，簇生；子囊(66～75)μm×(14.5～22)μm(M=70 μm×17.4 μm,n=20)，圆柱状，双侧壁，子囊顶端有可见小室(图版2D-e)，几乎不具柄；孢子(18～24)μm×(4.7～6.8) μm(M=21 μm×5.8 μm,n=20)，8个孢子有序叠压排列在子囊中，椭圆形，无色，无隔膜，表面光滑(图版2D)。

注：图A、B中a-b和图C、D中a-c为子囊果形态; 图A中c-d, B中c, C中d-e 为子囊果纵切面及子囊果壁细胞结构; 图A中f-i, 图B中d-i, 图C中f-l, 图D中
d-i为子囊及孢子; 图A中e为子囊与侧丝，j为萌发孢子，k-l为PDA菌落形态；标尺: A图中c-e, C图中d均为100 μm; 图B中c, C中f-h, D中d-i均为30 μm; 图A中f-g, 图B中d-f, C中e，i-l均为20 μm; 图A中h-j, 图B中g-i均为10 μm。

Note: a-b(A, B) and a-c(C, D) showed ascocarp shape; c-d(A), c(B) and d-
e(C) showed vertical section and parietal cell of ascocarp; f-i(A), d-i(B), f-l(C) and d-i(D) were asci and spores; e(A) showed ascus and paraphysis. j was germinating spore. k-l, PDA colonial morphology. Scaleplate: c-e(A) and
d(C) was 100 μm; c(B), f-h(C) and d-i(D) was 30 μm; f-g(A), d-f(B), e,i-l(C) was 20 μm; h-j(A), g-i(B) was 10 μm.
图版1 Rhytidhysteron rufulum，Phoma exigua，Lophiostoma macrostomum和Phaeosphaeria avenaria的形态
Fig.1 Morphology of Rhytidhysteron rufulum, Lophiostoma macrostomum and Phaeosphaeria avenaria
注：图中所有a-b为寄主表面分生孢子器及子囊果形态; 图A中c-d和B中c-e
为分生孢子器纵切面及分生孢子梗产孢结构; 图C中c-h, D中c-f为子囊及子囊孢子; 图A中e-f, 图B中f-g为分生孢子; 图A和D中g, 图C中i为萌发孢子。

标尺: 图A中c为50 μm，图B中c为30 μm; 图A中d-g, 图C中c-i, 图D中c-g 均为20 μm; 图B中d-g为15 μm。

Note: a-b, pycnidium and ascocarp shape; c-d(A) and c-e(B) showed vertical section of pycnidium and conidial fructification of conidiophores; c-h(C) and c-f(D) were asci and ascospores; e-f(A), f-g(B) were conidia. g(A,
D) and i(C) were germinating spores. Scaleplate: c(A) was 50 μm; c(B) was
30 μm; d-g(A), c-i(C) and c-g(D) was 20 μm; d-g(B) wa s 15 μm.
图版2 Lasiodiplodia pseudotheobromae，Botryosphaeria dothidea，Microdochium phragmitis和Pestalotiopsis foedans的形态
Fig.2 Morphology of L. pseudotheobromae, B.a dothidea, M. phragmiti and P. foedans
注：图中所有a-b为寄主表面子囊果形态; 图A和C中c-e, B中c-d, D中c为子囊及侧丝; 图A中f-g, B中e-f, C中f, D中d为子囊孢子; C中g, D中e为萌发孢子; A中h, B中g-h, D中f-g为分生孢子器的菌落形态。

标尺: 图C中c-d, 图D中c-e为30 μm; 图A中c-g, B中c-g, C中e-g为20 μm; 图B中e-f为10 μm。

Note: a-b showed scaleplate shape; c-e(A, C), c-d(B) and c(D) were asci and paraphyses; f-g(A), e-f(B), f(C) and d(D) were ascospores; g(C) and e(D) were germinating spores; h(A), g-h(B) and f-g(D) showed colonial morphology of pycnidium. Scaleplate: c-d(C) and c-e(D) was 30 μm; c-g(A), c-g(B) and e-g(C) was 20 μm; e-f(B) was 10 μm.
图版3 Phoma macrostoma，Anteaglonium parvulum，Astrosphaeriella stellata和Byssosphaeria schiedermayeriana的形态
Fig.3 Morphology of P. macrostoma, A. parvulum, A. stellata and B. schiedermayeriana
2.2.9 Phoma macrostoma 生长在竹子茎部，子囊果埋生在寄住组织内，簇生，
将寄住组织顶裂，黑色；子囊(73～87) μm×(5～6.6)μm(M=80 μm×6
μm,n=20)，棍棒状，多数弯曲，双层壁，具有分叉的短柄，顶端圆钝；子囊孢子(11.2～14.5)μm×(3.4～4.4)μm(M=12.5 μm×3.7 μm,n=20)，8个孢子有序排列于子囊中，无色，纺锤形，1隔膜，表面光滑(图版3A)。

2.2.10 Anteaglonium parvulum 多生长于腐木表面，子囊果黑色，簇生或单生，能产生红色代谢产物，子囊果壁碳质化；子囊(53～67)μm×(
3.5～5.2)μm(M=58 μm×
4.6 μm)，棍棒状，具短柄，子囊间有大量侧丝，子囊双层壁；子囊孢子(7～9)μm×(3～4.2)μm(M=7.6 μm×3.4 μm,n=20)，8个孢子有序排列，无色，纺锤形，1膈膜，在膈膜处明显缢进，两部分偶尔对称，多数上端偏大，下端偏小，孢子表面光滑(图版3B)。

2.2.11 Astrosphaeriella stellata 生长在腐烂的竹子杆表面，子囊果较大，半圆状，直径700～1 050 μm，单生或簇生，黑色，子囊果壁碳质化，子囊果壁厚度为40～85 μm；子囊(130～180)μm×(8～1
3.5)μm(M=170 μm×10 μm，n=20)，似棍棒状，子囊间有大量侧丝，子囊双层壁，具有分叉的长柄；子囊孢子(35～49)μm×(5～8)μm(M=44 μm×6 μm,n=20)，8个孢子有序排列于子囊中，初期
孢子无色，成熟后有点褐色，孢子具角质壳，两端具平截(图版3C-f)，孢子1隔膜，中间隔膜处微微缢进，表面光滑(图版3C)。

2.2.12 Byssosphaeria schiedermayeriana 生长于腐木表面，子囊果扁圆形，直
径200～300 μm，大多数簇生，黑色，子囊果顶部生有小孔，孔周围有大量附属
丝；子囊(160～180)μm×(14～18)μm(M=172 μm×16.5 μm,n=20)，子囊间有大量侧丝，子囊壁双层壁，具长柄；子囊孢子(30～42)μm×(5～8)μm(M=36.5 μm×6.5 μm,n=20)，8个孢子有序排列，成熟孢子褐色，纺锤形，两端尖锐，1隔膜，表面光滑(图版3D)。

3 结论与讨论
1) 通过对茂兰自然保护区子囊菌亚门真菌多样性的初步调查，共采集子囊菌亚门真菌标本110份，隶属于11属，12个不同的种，其中出现频率较高的种为Rhytidhysteron rufulum、Astrosphaeriella stellata、Anteaglonium parvulum，说明这几种真菌在该保护区存在类群较大，对进一步了解该保护区真菌种群丰富度提供基础。

2) 基于形态分类研究所存在的不足和弊端，分类学家开始把分子系统学理论引入真菌的分类学研究。

目前，分子系统学已被广泛应用于真菌的分类学研究[12]。

所以，此次调查通过采用形态学特征与分子学特征相结合的分类鉴定方法，更准确有效的鉴定了真菌的分类地位，丰富了真菌多样性资源，对保护区真菌多样性的研究有重要的价值。

3) 茂兰自然保护区属中亚热带季风湿润气候，保护区的喀斯特森林是目前世界罕见的中亚热带喀斯特原生性较强的残存森林，是地球上唯一幸存下来的喀斯特森林生态系统，很适合子囊菌亚门真菌生长繁殖。

由于调查季节有限，此次调查并不是很全面，所以值得进一步进行调查研究，旨在丰富茂兰自然保护区真菌种类资源，更好地保护该区微生物多样性群落。

[参考文献]
[1] 陈正仁.茂兰资源植物及开发利用初探[J].贵州林业科技,1998,26(4):31-36.
[2] 周政贤.茂兰喀斯特森林科学考察集[M].贵阳:贵州人民出版社,1987.
[3] 冉景丞,陈会明,熊志斌.贵州茂兰国家级自然保护区鸟类调查[J].贵州林业科
技,2003,8(3):26-32.
[4] 李子忠,金道超.茂兰景观昆虫[M].贵阳:贵州科技出版社,2002.
[5] 陈会明.贵州茂兰喀斯特自然保护区的蜘蛛种类[J].山地农业生物学
报,2003,22(2):127-135.
[6] 吴兴亮,王季槐.贵州茂兰喀斯特森林区真菌的种类组成及其生态分布[J].生态学报,1993,13(4):306-312.
[7] 张纪忠.微生物分类学[M].上海:复旦大学出版社,1990.
[8] 裘维蕃,余永年.菌物学大全[M].北京:科学出版社,1998.
[9] 黄浩,肖正端,邓春英，等.广东石门台自然保护区大型真菌多样性研究[J].广东林业科技,2010,26(5):40-44.
[10] 方毅,胡殿明,刘仁林，等.江西武夷山自然保护区大型真菌调江西林业科技报[J].江西林业科技,2008(5)：33-35.
[11] Liu J K, Rungtiwa P, Gareth Jones E B, et al. Astrosphaeriella is polyphyletic, with species in Fissuroma gen.nov., and Neoastrosphaeriella gen. nov[J]. Fungal diversity.2011(51):135-154.
[12] James T Y, Kauff F, Schoch C L, et al. Reconstructing the early evolution of the fungi using a six gene phylogeny[J].Nature,2006(443):818-822.
[13] Kirk P M, Cannon F D, Minter D W, et al .10th dictionary of the Fungi[M].Wallingford:CAB International,2008.。