超临界二氧化碳萃取灵芝总三萜的工艺研究

收稿日期:2007206215;　修订日期:2007209211
基金项目:贵州省优秀科技教育人才省长专项资助项目(No .2005293)作者简介:杨　军(19722),男(苗族),贵州松桃人,现任中国科学院地球化学研究所助理研究员,硕士学位,主要从事生物资源开发利用及超临界流体技术研究工作.3
通讯作者简介:罗喜荣(19732),女(汉族),贵州松桃人,现任贵阳医学院讲师,硕士学位,主要从事天然药物的提取及其药理学研究工作.超临界二氧化碳萃取灵芝总三萜的工艺研究
杨　军1
,余德顺1
,罗　俊2
,罗喜荣
23
(1.中国科学院地球化学研究所,贵州贵阳　550002;　2.贵阳医学院,贵州贵阳　550004)
摘要:目的探讨超临界C O 2萃取灵芝总三萜的优化工艺条件。

方法采用响应曲面法考察萃取压力、
萃取温度、夹带剂用量对灵芝总三萜萃取率的影响。

结果优化萃取条件为:萃取压力30M Pa,萃取温度51℃,夹带剂用量2.2m l/g 。

结论该方法简便准确,预测性好。

关键词:灵芝;　
总三萜;　超临界二氧化碳萃取;　响应曲面法中图分类号:R284.2 文献标识码:A 文章编号:100820805(2008)0320539202
Study on the Supercr iti ca l Carbon D i ox i de Extracti on Process of Tot a l Tr iterpeno i ds from
G anoder m a lucidum
Y ANG J un 1,Y U D e 2shun 1
,
LUO J un 2
,LUO X i 2r ong
23
(1.Institu te of Geoche m istry,Ch inese A cade m y of Sciences,Guiyang 550002,China;2.Gu iyang M edica l Col 2lege,Gu iyang 550004,China )
Abstract:O bjecti ve To investigate the op ti m u m extracti on of t otal triter penoids fr om Ganoder m a lucidum by supercritical carbon
di oxide extracti on .M ethods The res ponse surface methodol ogy was app lied in the analysis of extracti on parameters such as extrac 2ti on p ressure,extracti on te mperature and entainer dosage .Results The op ti m al extracti on conditi ons were extracti on p ressure 30MPa,extracti on te mperature 51℃,entainer dosage 2.2m l/g .Conclusi on The res ponse surface methodol ogy used in this study is able t o p redict the op ti m al extracti on conditi ons for the t otal yield of t otal triter penoids in Ganoder m a lucidum .
Key words:Ganoder m a lucidum ;　Total triter penoids;　Supercritical C O 2extracti on;　Res ponse surface methodol ogy
灵芝(Ganoder ma )为层菌纲非褶菌目灵芝菌科灵芝属真菌的总称。

习惯所称灵芝是指灵芝属中赤芝Ganoder m a lucidum (Leyss .Ex Fr .)Karst .的子实体部分,其主要成分之一是三萜类化合物,由赤芝中发现的三萜类化合物已有135种,如赤芝酸A,赤芝酸B,灵芝酸A,灵芝酸B 等[1]。

该类化合物有较高的脂溶性,分子量一般为400～600,化学结构较复杂,目前已知有7种不同的母核结构,在母核上有多个不同的取代基,常见有羧基、羟基、酮基、甲基、乙酰基和甲氧基等。

由于化学结构的多样性,使灵芝三萜类化合物具有抗肿瘤、抗H I V -1及H I V -1蛋白酶活性、抗氧化、抑制组胺释放、抑制胆固醇合成、抑制血小板聚集、保
肝、镇痛等较广泛的药理活性[2]。

目前国内市场上灵芝药品、保健品种类繁多,很多灵芝产品以总三萜作为标志性功效成分。

灵芝三萜类化合物不仅是当前灵芝化学及药理研究的热点,而且具有较好的工业应用前景。

灵芝总三萜的提取分离一般采用甲醇或乙醇浸提,粗提物用氯仿溶解经碱处理分出总酸部分后再用氯仿萃取分离得到,但该方法存在耗时耗能、溶剂用量大、有溶剂残留、生产成本高等缺点[3,4]。

超临界C O 2萃取技术具有步骤简单、选择分离效果好、提取率高、产物无溶剂残留、有利于脂溶性物质和热敏性物质的萃取等优点,已被广泛应用于香料及中草药成分的提取。

本文采用Box -Behnken 响应曲面法对超临界C O 2萃取灵芝总三萜工艺进行优化,寻找最佳工艺条件,为进一步规模化提取灵芝总三萜奠定基础。

1　材料与仪器
赤芝购于贵州省药材公司,破碎成10～20目颗粒备用;熊果
酸标准品购于中国药品生物制品检定所;4L 超临界萃取装置(自行研制);T6新世纪紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司);所用化学试剂均为分析纯。

2　方法2.1　灵芝总三萜的提取采用Box -Behnken 响应曲面设计法,以萃取压力、萃取温度、夹带剂用量〔夹带剂体积(m l )/灵芝原料重量(g )〕为自变量,以灵芝总三萜萃取率为响应指标设计三因素三水平实验方案,实验因素编码及水平设计见表1。

表1　实验因素编码及水平
因素
编码
水平
-101萃取压力p /MPa
X 11522.530萃取温度T /℃X 2405060夹带剂用量C /m l ・g -1
X 3
2
3
4
取赤芝粉200g 置于超临界萃取器,设定萃取时间为1h,C O 2流量为20L /h,解析压力为5MPa,解析温度为60℃。

当达到预定温压条件,启动夹带剂泵,定量打入95%乙醇,萃取过程中从解析器收集萃取液,实验结束后减压回收乙醇,真空干燥得红褐色固体。

2.2　灵芝总三萜含量的测定采用分光光度法[4,5],以熊果酸为对照品,5%香草醛-冰醋酸和高氯酸为显色剂,60℃水浴15m in,在最大吸收波长540n m 处测定吸光度,绘制浓度和吸光度的标准曲线,得回归方程:Y =3.628X -0.094,r =0.9994,线性范围0～0.25mg/m l 。

精密称取灵芝超临界萃取物样品50mg,同法显色测定,根据标准曲线计算总三萜含量及萃取率(Y )。

Y (%)=萃取物中总三萜含量(g )/灵芝原料重量(g )×100%3　结果与讨论3.1　实验结果及模型方程的建立灵芝总三萜的超临界CO 2提取响应曲面实验设计方案与实验结果见表2。

利用M initab 15软件对表2实验数据进行多元回归拟合,得响应曲面二次多元回归模型:Y =-0.5633+0.0573X 1
+
0.0438X 2-0.2113X 3-0.0011X 12-0.0005X 22
+0.0183
・
935・L I SH I Z HE N MED I C I N E AND MATER I A ME D I CA RESEARCH 2008VOL.19NO.3
时珍国医国药2008年第19卷第3期
X 32
+0.0001X 1X 2+0.001X 1X 3+0.002X 2X 3
对该模型进行方差分析结果见表3,回归模型系数显著性检
验结果见表4。

由表3可知模型P =0.002<0.01表明该模型极显著,失拟项P =0.246>0.05不显著,r 2=0.9720说明该模型拟合程度良好,试验误差小,可以用此模型对灵芝总三萜的超临界CO 2提取进行分析和预测。

由表4可知模型中一次项X 1、二
次项X 12和X 22
显著,其他项不显著。

表2　实验设计方案及结果
实验号
X 1X 2X 3Y (%)1
-1-100.8421-10 1.143-1100.834110 1.165-10-10.94610-
1 1.157-1010.968101 1.2090-1-1 1.061001-
1 1.03110-11 1.0712011 1.1213000 1.1214000 1.0815
1.11
表3　回归模型的方差分析
方差来源自由度
平方和
均方
F P
r 2
模型90.
17530.019519.320.0020.9720
残差50.00500.0010失拟项30.00420.0014 3.21
0.246
纯误差20.00090.000
4
总和14
0.180
4
表4　回归模型系数显著性检验
系数项
自由度
回归系数
标准差
t P
常量
1-0.56330.6020-0.9360.392X 110.05730.0181 3.1590.025X 210.04380.0179 2.4490.058X 31-0.21130.1361-1.5520.181X 121-0.00110.0003-3.5800.016X 221-0.00050.0002-3.1260.026X 3210.01830.0165 1.1090.318X 1X 210.0001
0.000
20.4720.657
X 1X 310.
0010.00210.4720.657X 2X 3
1
0.
002
0.001
6
1.
2600.263
3.2　响应曲面分析与优化模型响应曲面图见图1～3。

由图1可知保持萃取压力不变,随着萃取温度升高灵芝总三萜萃取率逐步增加;保持萃取温度不变,随着萃取压力增加灵芝总三萜萃取
率快速增加。

由图2可知保持萃取压力不变,随着夹带剂用量增加灵芝总三萜萃取率逐步增加;保持夹带剂用量不变,随着萃取压力增加灵芝总三萜萃取率快速增加。

由图3可知保持萃取温度不变,随着夹带剂用量增加灵芝总三萜萃取率逐步增加;保持夹带剂用量不变,随着萃取温度升高灵芝总三萜萃取率逐渐增加,达到峰值后缓缓下降。

图1　萃取压力和萃取温度对灵芝总三萜萃取率的交互作用响应曲面
图2　萃取压力和夹带剂用量对灵芝总三萜萃取率的交互作用响应曲面
图3　萃取温度和夹带剂用量对灵芝总三萜萃取率的交互作用响应曲面
对模型方程解逆矩阵得灵芝总三萜最佳提取工艺条件为:萃取压力29.30M Pa,萃取温度51.09℃,夹带剂用量2.18m l/g 。

为检验响应曲面法所得结果的可靠性,采用上述优化提取条件进行灵芝总三萜的超临界CO 2提取,为方便实际操作将提取工艺参数修正为:萃取压力30M Pa,萃取温度51℃,夹带剂用量2.2m l/g,此条件下灵芝总三萜理论萃取率为1.17%,验证结果见表5。

实际测得的灵芝总三萜平均萃取率为1.16%,与理论预测值非常接近,表明基于响应曲面法所得的优化提取工艺参数准确可靠,具有实用价值。

表5　模型的验证结果
%实验号
萃取物中总三萜含量
Y
154.
07 1.16251.92 1.143
52.38 1.19平均
52.
79
1.
16
4　结论
通过响应曲面法建立了灵芝总三萜萃取率与萃取压力、萃取温度、夹带剂用量关系的回归模型,经检验证明该模型准确有效,超临界CO 2萃取灵芝总三萜最佳工艺条件为:萃取压力29.30M Pa,萃取温度51.09℃,夹带剂用量2.18m l/g 。

从便于实际操作出发,将最佳工艺条件优化为:萃取压力30MPa,萃取温度51℃,夹带剂用量2.2m l/g,在此条件下灵芝总三萜平均萃取率
为1.16%,萃取物中总三萜平均含量为52.79%,有利于灵芝新产品的研究与开发。

参考文献:[1]　高建莉,禹志领,李绍平,等.灵芝三萜类成分研究进展[J ].中国食用菌,2005,24(4):6.[2]　罗　俊,林志彬.灵芝三萜类化合物药理作用研究进展[J ].药学学报,2002,37(7):574.
[3]　钱　竹,徐　鹏,章克昌,等.大孔树脂分离提取发酵液中灵芝三萜类物质[J ].食品与生物技术学报,2006,25(6):111,126.[4]　江绍琳,江绍玫,曾令聪.分光光度法快速测定灵芝中总三萜含量
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[5]　王彩云,郝晓宏,谷日旭,等.分光光度法测定灵芝孢子油中的总三
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045・时珍国医国药2008年第19卷第3期
L I SH I ZHEN MED I C I N E AND MATER I A MED I CA RESEARCH 2008VOL.19NO.3　。