第十章第五讲PCR技术

第十章第五讲 PCR技术
一学习目标
1.掌握PCR技术的过程及应用
二知识梳理及拓展
1.PCR的基本原理
▪试管中进行的DNA复制反应，依据
①DNA半保留复制的机理；
②体外DNA分子于不同温度下可变性和复性的性质；
▪通过人为控制体外合成系统的温度，使
①双链DNA变成单链，
②单链DNA与人工合成的引物退火，
③DNA聚合酶使引物沿着单链模板延伸为双链DNA。

2.PCR反应体系
▪4种dNTP混合物各200umol/L
▪引物各10～100pmol
▪模板DNA 0.1～2ug
▪Mg2+
3.PCR的基本步骤
▪ 1.变性：高温使双链DNA解离形成单链（94℃，30s）。

▪ 2.退火：低温下，引物与模板DNA互补区结合（55℃，30s）。

▪ 3.延伸：中温延伸。

DNA聚合酶催化以引物为起始点的DNA链延伸反应（70～72℃，30～60s）
◆PCR每一步的转换通过温度的改变控制。

DNA模板解链（变性）、引物与模板结合（退
火）、DNA聚合酶催化新生DNA的合成（延伸）三个步骤构成PCR反应的一个循环。

◆此循环反复进行，可使目的DNA得以迅速扩增。

◆理论扩增率：2n递增（n为循环次数），25～30循环，目标DNA可增加109倍。

◆扩增N次后，目的基因占比例为（2n -2n）／2n
◆由于引物和底物的消耗，酶活力的下降等因素，扩增产物的增加，逐渐由指数形式
变为线性形式，所以实际上进行30个循环后，扩增倍数一般可达106～107。

◆以上“变性、退火、延伸”三部曲为PCR一轮循环。

三考点梳理
1、利用PCR技术，把一个双链DNA分子当作第一代，经过3次循环，在第四代DNA分子中，有几条第一代脱氧核苷酸的长链？（）
A．2 B．4 C．8 D．16
2、多聚酶链式反应（PCR）是一种体外迅速扩增DNA片段的技术。

请回答下列有关PCR技术的基本原理及应用问题。

（1）DNA的两条链是反向平行的，通常将__________的末端称为5′端，当引物与DNA母链通过碱基互补配对结合后，DNA聚合酶就能从引物的__________开始延伸DNA链。

（2）PCR利用DNA的热变性原理解决了打开DNA双链的问题，但又导致了DNA聚合酶失活的新问题。

到20世纪80年代，科学家从一种Taq细菌中分离到__________ ，它的发现和应用解决了上述问题。

要将Taq细菌从其他普通的微生物中分离出来，所用的培养基叫__________。

（3）PCR的每次循环可以分为__________ 三步。

假设在PCR反应中，只有一个DNA 片段作为模板，请计算在5次循环后，反应物中大约有__________个这样的DNA片段。

（4）请用简图表示出一个DNA片段PCR反应中第二轮的产物。

（5）简述PCR技术的主要应用。

四课后习题
1.PCR是一种DNA体外扩增技术。

1988年，PCR仪问世，并被广泛应用于
基因扩增和DNA序列测定。

如图是PCR技术示意图，请回答下列问题：（11分/6min）
①标准的PCR过程一般分为、、三大步骤。

②引物是此过程中必须加入的物质，从化学本质上说，引物是一小段。

③将双链DNA______________ ，使之变性，从而导致。

④引物延伸需提供作为原料。

2.α1﹣抗胰蛋白酶是肝脏产生的一种糖蛋白，缺乏会引起肺气肿。

某公司成功研制出转基因羊，进入泌乳期后，其乳汁中含有人类的α1﹣抗胰蛋白酶，用于治疗肺气肿。

问答下列问题：
（1）为获取目的基因，需要在肝细胞中提取，通过反转录产生cDNA，再通过技术进行快速扩增。

（2）将α1﹣抗胰蛋白酶基因与乳腺蛋白基因的等调控组件重组在一起，构建基因表达载体，然后通过技术，导入羊的受精卵中。

（3）受精卵通过早期胚胎培养，一般发育到阶段，通过胚胎移植到受体子宫孕育。

为选育出能泌乳的雌羊，移植前须从胚胎的部位取样，做DNA分析鉴定性别。

（4）α1﹣抗胰蛋白酶是一种结构较复杂的糖蛋白，因此用上述方法生产，相对传统的转基因大肠杆菌生产，优势在于。

3．基因表达载体的构建是基因工程的核心。

图1为限制酶EcoRⅠ的识别序列，图2表示目的基因及限制酶切点，图3表示目的基因上的DNA片段，图4表示质粒。

请回答下列问题：
（1）若用图1所示的限制酶EcoRⅠ切割外源DNA，就其特异性而言，切开的是
之间相连的化学键。

（2）图3为目的基因中的某一片段，下列有关叙述正确的是。

A．若图中的ACT能决定一个氨基酸，则ACT可称为一个密码子
B．DNA聚合酶和DNA连接酶都可作用于②处，解旋酶作用于①处
C．若只用这个片段中的3个碱基对，排列出的DNA片段有64种
D．就游离的磷酸基而言，该片段与重组质粒相比多了2个游离的磷酸基
（3）若利用PCR技术增加目的基因的数量，由图2可知，A、B、C、D四种单链DNA片段中应选取作为引物（DNA复制子链的延伸方向5′→3′）。

该DNA分子在PCR仪中经过4次循环后会产生等长的目的基因片段个。

（4）为了使目的基因和质粒定向连接并且有利于受体细胞的筛选，提高重组效率，应该选择的限制酶是。

如果用限制酶PstⅠ、EcoRⅠ和HindⅢ同时对质粒进行切割，假设同时只有任意两个位点被切断且每次机会相等，则形成含有完整抗四环素基因的DNA片段有种。

（5）如果大肠杆菌是受体细胞，则其体内应不含基因，以利于筛选出含重组质粒的受体菌。

目的基因能在大肠杆菌细胞内表达出相同的蛋白质，其遗传学基础是。

4．已知某传染性疾病的病原体为RNA病毒，该病毒表面的A蛋白为主要抗原，制备抗A 蛋白抗体的部分流程如下图：
请回答：
（1）①代表的是过程。

为获得A基因表达载体，需用酶对A基因和运载体进行切割。

将A基因表达载体导入动物细胞常用的方法是。

（2）利用PCR技术扩增A基因时，设计引物序列的主要依据是，
加入引物的作用是。

（3）与体内DNA复制相比较，PCR反应要在一定的缓冲溶液中才能进行，并且要严格控制等条件。

（4）过程③采用的技术是，获得的X叫细胞。

课后习题答案
1.【解析】①标准的PCR过程一般分为高温变性、低温复性、中温延伸三大步骤．
②引物是一小段单链DNA或RNA。

③高温变性时，需要将双链DNA加热到95℃，使之变性，从而导致双链DNA分离成两条单链。

④中温延伸是需要以四种脱氧核苷酸为原料。

【答案】①变性复性延伸②单链DNA或RNA ③加热到95℃双链DNA分离成两条单链
④四种脱氧核苷酸
2.【解析】（1）α1﹣抗胰蛋白酶基因在肝细胞中表达，所以可以在肝细胞中提取mRNA，反转录产生相应cDNA，再通过PCR扩增。

（2）为了使α1﹣抗胰蛋白酶基因在乳腺细胞中表达，需要将其与乳腺蛋白基因的启动子等调控组件重组，构建基因表达载体，然后通过显微注射技术，导入受精卵中。

（3）牛和羊的胚胎一般发育到桑椹胚或囊胚，再进行胚胎移植；DNA分析鉴定性别须从胚胎的滋养层部位取样，这样既保证了遗传信息一致，又不影响内细胞团进一步发育。

（4）糖蛋白的形成需要进行蛋白质的加工，相对原核细胞而言，羊细胞有内质网和高尔基体，具备蛋白质加工的能力。

【答案】（1）mRNA PCR
（2）启动子（或启动子、终止子）显微注射
（3）桑椹胚或囊胚滋养层
（4）羊细胞有内质网和高尔基体，具备蛋白质加工的能力
3.【解析】（1）DNA分子的一条多核苷酸链中，两个脱氧核苷酸之间以磷酸基团和五碳糖相连．由题目可知，EcoRⅠ识别的DNA序列只有G和A，故切开的是鸟嘌呤脱氧核苷酸和腺嘌呤脱氧核苷酸之间相连的化学键。

（2）A．密码子是mRNA上决定一个氨基酸的3个相邻的碱基，若图中的ACT能决定一个氨基酸，则其对应的密码子是UGA，A错误；
B．DNA聚合酶和DNA连接酶都可作用于②磷酸二酯键处，解旋酶作用中①氢键处，B正
确；
C．A和T之间有2个氢键，C和G之间有3个氢键，因此若只用这片段中的3个碱基对，可以排列出23种片段，C错误；
D．就游离的磷酸基而言，该片段有2个游离的磷酸基，而重组质粒不含游离的磷酸基，因此该片段与重组质粒相比多了2个游离的磷酸基，D正确。

故选：BD。

（3）若利用PCR技术增加目的基因的数量，由图2可知，DNA复制只能从5’到3’，因此构建前利用PCR技术扩增干扰素基因时，A、B、C、D四种单链DNA片段中应选取B和C 作为引物，该DNA分子在PCR仪中经过4次循环后会产生基因片段16个，其中等长的目的基因片段8个。

（4）为了使目的基因和质粒定向连接并且有利于受体细胞的筛选，提高重组效率，四环素抗性基因没有被破坏，gu8 应该选择的限制酶是PstⅠ、EcoRⅠ。

如果用限制酶PstⅠ、EcoR Ⅰ和HindⅢ同时对质粒进行切割，假设同时只有任意两个位点被切断且每次机会相等，若Pst I酶的切割位点用1表示，EcoR I酶的切割位点用2表示，HindⅢ酶的切割位点用3表示，则形成的DNA片段1→2，2→1，2→3，3→2，1→3，3→1六种片段，其中只有2→1片段含有完整四环素抗性基因，即含有完整四环素抗性基因的DNA片段只有1种。

（5）如果大肠杆菌是受体细胞，则其体内应不含抗四环素基因，以利于筛选出含重组质粒的受体菌。

目的基因能在大肠杆菌细胞内表达出相同的蛋白质，其遗传学基础是各种生物共用一套密码子。

【答案】（1）鸟嘌呤脱氧核苷酸和腺嘌呤脱氧核苷酸
（2）BD
（3）B和C 8
（4）PstⅠ、EcoRⅠ1
（5）抗四环素基因各种生物共用一套密码子
4.【解析】（1）由以上分可知①是逆转录过程．构建基因表达载体时，首先需要用同种限制酶切割含有目的基因的外源DNA和运载体，其次需要用DNA连接酶将目的基因与运载体连接形成重组DNA．将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法。

（2）利用PCR技术扩增A基因时，根据A基因两端的部分核苷酸序列设计引物序列，加入引物的作用是与A基因单链相应互补序列结合，然后再DNA聚合酶作用下进行延伸。

（3）PCR扩增目的基因的过程：①高温变性：DNA解旋过程（PCR扩增中双链DNA解开不需要解旋酶，高温条件下氢键可自动解开）；低温复性：引物结合到互补链DNA上；③中温延伸：合成子链。

因此，与体内DNA复制相比较，PCR反应要在一定的缓冲溶液中才能进行，并且要严格控制温度等条件。

（4）③过程需要采用动物细胞融合技术，根据图中信息可知X为杂交瘤细胞。

【答案】（1）逆转录限制显微注射法
（2）A基因两端的部分核苷酸序列与A基因单链相应互补序列结合，然后再DNA聚合酶作用下进行延伸
（3）温度
（4）动物细胞融合杂交瘤。