基因工程的操作过程
基因工程的操作步骤
利用PCR技术扩增目的基因
原理: DNA双链复制 前提: 要有一段已知 目的基因的脱 氧核苷酸序列, 以便合成引物。
过程
预变性 增加DNA变性的概率
高温变性 解旋为单链
低温退火 引物与单链互补结合 适温延伸 在Taq酶的作用下合成
与模板互补的DNA双链 重复循环
归纳: 基因工程的基本操作程序. 构建基因表达载体
目的基因、启动子、终止子、标记基因
3. 将目的基因导入受体细胞
农杆菌转化法、显微注射法
4. 目的基因的检测与鉴定
检测：是否插入、转录、翻译
基因操作的基本步骤
基因操作的基本步骤
终止子：位于基因的尾端的一段特殊的DNA片断,它能阻碍RNA聚合酶的移动, 并使其从DNA模板链上脱离下来,使转录终止。
RNA聚合酶:能够识别启动子上的结合位点并与其结合的一种蛋白质. 以模板转录 然后脱落
非编码区 编码区上游 启动子
编码区
非编码区 编码区下游 终止子
原核 细胞 的基 因结
构
编码区 能转录相应的信使RNA,能编码蛋白质
知识点二.基因工程基本操作的四个步骤
1、目的基因的获取
2、基因表达载体的构建
3、将目的基因导入受体细 胞
4、目的基因的检测与鉴定
一、获取目的基因
目的基因主要是__编__码__蛋__白__质__的__结__构__基__因__
1.获取目的基因的途径
A.从自然界已有的物种中分离
B.人工合成
2.获取目的基因的方法
四、目的基因的检测与鉴定
检测:
是否插入目的基因 DNA分子杂交技术 是否转录 mRNA分子杂交技术 是否翻译 抗原—抗体杂交技术
基因工程基本操作过程
基因工程基本操作过程基因工程基本操作过程基因工程（Gene Engineering）是指使用分子生物学技术来改造细胞的过程。
下面我们将介绍基因工程的基本操作过程：一、制备基因：1、搜集基因：首先根据要求选择合适的基因来构建一个基因组。
2、克隆基因：将选定的基因提取出来并复制多份，使得可以获得相当数量的基因，以便后续的基因工程。
3、比较基因：对不同基因的序列进行比较，以了解基因的相似性和差异性，这是判断基因是否有用的重要依据。
4、无编码的RNA转录：将DNA 序列转录成RNA 序列，以及无编码RNA（rRNA）的转录，其中，rRNA 是控制基因表达水平的重要因素之一。
二、构建基因组：1、生成基因组：将制备的基因进行拼接成合适的串联，形成某一特定的基因组。
2、调节基因表达：通过调节基因组中基因的表达水平，使其达到适当的状态，以获得最大的效果，可以采用基因转录调节、基因表达调节等技术。
3、重组基因：改变基因组中基因的构型或序列，从而得到新的可用基因，可以采用重组质粒、 PCR（聚合酶链反应）技术等。
三、进行工程化：1、在细胞中引入外源基因：将制备的基因组注入细胞中，使其形成线粒体遗传系统，从而改变细胞的特性。
2、提取细胞中的基因：从细胞中提取所需要的基因，以便进行分析和研究。
3、可视化基因分析：对细胞中的基因进行可视化分析，以了解基因的结构及作用，可以采用流式细胞术、免疫组化等技术。
四、应用基因工程技术：1、制作新的药物：利用基因工程技术可以设计新的药物，以治疗疾病2、生产更优质的农作物：通过改造作物自身的基因，可以获得更高品质的农作物，提高农业的生产效率。
3、开发先进的器械设备：基因工程技术可以应用于开发先进的机械设备，以提高工程制造的效率和质量。
以上就是基因工程的基本操作过程，在实际应用中，可以结合不同的技术，创新性的进行工程化以实现一定的目的。
第10章 基因工程的操作过程
2.将目的基因导入动物细胞
（1）方法：显微注射法（将基因表达载体 提纯，用显微仪注射到受精卵中）
2.将目的基因导入动物细胞
（2）操作程序:
提纯含目的基因表达载体 显微注射
受精卵
早期胚胎培养 移植到子宫 新性状动物
3.将目的基因导入微生物细胞
常用法：CaCl2法（ Ca2+增加细菌细胞的通透性）
二、将目的基因导入受体细胞
受体细胞 内，并且在 目的基因进入 _________ （一）转化： 表达 的过程 受体细胞内维持稳定 _____和_____ 将目的基因导入 植物细胞
农杆菌转化法 基因枪法 花粉管通道法
（二）方法
将目的基因导入 ——显微注射法 动物细胞
将目的基因导入 ——氯化钙法（感受 微生物细胞 态细胞）
载体携带两个抗生素抗性基因，外源基因插入其中一
个基因内导致其失活，用两种抗生素平板筛选重组子。 第一步：正选择。在不进行插入失活抗性基因的相应 抗生素平板上转化子可以生长，非转化子不能生长， 可将转化子直接从平板上挑出来； 第二步：负选择。在插入失活抗性基因的相应抗生素 平板上转化子中的非重组子（未插入外源基因）可以 生长，重组子（插入外源基因）不能生长，应与第一 种抗生素板进行对照并在其上挑出含重组子的菌落。
2、过程:
质粒 DNA分子 同一种 限制酶处理
一个 切口 两个 黏性末端
两个 切口 获得目的基因
DNA连接酶 重组DNA（重组质粒）
3、基因表达载体的组成：
a、目的基因
启动子
目的基因
表 达 载 体
b、启动子 c、终止子 d、标记基因
表达载体
复制原点 标记基因
终止子
e、复制原点
第三章 基因工程 第2节 基因工程的基本操作程序
第2节基因工程的基本操作程序一、目的基因的筛选与获取1．培育转基因抗虫棉的四个步骤(1)目的基因的筛选与获取。
(2)基因表达载体的构建。
(3)将目的基因导入受体细胞。
(4)目的基因的检测与鉴定。
2．目的基因的筛选与获取目的基因：在基因工程的设计和操作中，用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因。
主要指编码蛋白质的基因，如与生物抗逆性、优良品质、生产药物、毒物降解和工业用酶等相关的基因。
(1)筛选合适的目的基因：从相关的已知结构和功能清晰的基因中进行筛选。
(2)利用PCR获取和扩增目的基因①PCR的含义：PCR是聚合酶链式反应的缩写，它是一项根据DNA半保留复制的原理，在生物体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。
②目的：快速扩增目的基因。
③原理：DNA半保留复制。
④基本条件：DNA模板、4种脱氧核苷酸、2种引物、耐高温的DNA聚合酶、缓冲液。
⑤过程a．变性：当温度上升到90 ℃以上时，双链DNA解聚为单链。
b．复性：温度下降至50 ℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。
c．延伸：温度升至72 ℃左右时，溶液中的4种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链。
⑥结果：每一次循环后，目的基因的量可以增加一倍，即成指数形式扩增(约为2n，n为扩增循环的次数)。
⑦鉴定：采用琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物。
⑧仪器：PCR扩增仪。
(3)在获得转基因产品的过程中，还可以通过构建基因文库来获取目的基因。
【强化记忆】图1、图2分别是PCR扩增技术相关过程，请思考回答：(1)图1所示利用PCR技术扩增目的基因，在第几轮循环产物中开始出现两条脱氧核苷酸链等长的DNA片段？提示第3轮。
(2)图2是某同学设计的两组引物(只标注了部分碱基序列)都不合理，请分别说明理由。
提示第1组：引物Ⅰ和引物Ⅱ局部发生碱基互补配对而失效。
基因工程过程
基因工程过程
基因工程是通过对生物体的基因进行操作，使其具有新的性质或功能的一种技术手段。
它被广泛应用于生物学研究、农业生产和医学治疗等领域。
基因工程的过程包括以下几个步骤：
1.选择目标基因
在进行基因工程之前，首先需要确定需要操作的目标基因。
这通常需要对生物的遗传信息进行分析和研究，确定哪些基因具有重要性或潜在价值。
2.克隆目标基因
克隆目标基因是对基因工程来说非常重要的一步。
将目标基因从生物体中提取出来，并进行 PCR 扩增和克隆。
这通常需要将基因插入载体中，如质粒、病毒或细胞。
3.构建表达载体
在进行基因工程的过程中，表达载体是必不可少的。
表达载体可以将目标基因导入到宿主细胞中，并使其表达出目标蛋白质。
表达载体可以是质粒、病毒或其他载体。
4.转染宿主细胞
将构建好的表达载体转染到宿主细胞中。
这通常需要利用转染剂或其他工具来实现。
5.筛选目标细胞
在将表达载体转染到宿主细胞中后，需要进行筛选以找到目标细胞。
通常，这可以通过对细胞进行荧光或抗生素抗性选择来实现。
6.表达目标蛋白质
找到目标细胞后，可以开始表达目标蛋白质。
这需要对细胞进行培养和处理，以促进目标蛋白质的表达和分泌。
以上就是基因工程的基本过程。
通过这些步骤，可以制造出具有新功能或性质的生物体或者蛋白质。
基因工程已经得到广泛的应用，为生物学的研究和应用带来了革命性的变化。
基因工程操作步骤
1.目的基因DNA受热变性，解链； 2.引物与单链互补(hù bǔ)结合； 3.合成链在DNA聚合酶作用下进行延伸。
延伸
第十三页，共46页。
③过程(guòchéng)：
第十四页，共46页。
PCR技术( jìshù)的操作过程
PCR反应体系中目的基因成指数(zhǐshù)(2n)形
第二十六页，共46页。
3.基因表达载体(zàitǐ)的 a组、目成的：(mùdì)基因
b、启动子 c、终止子
位于基因的首端,是
mRNA结合位点
位于基因的末端,终止 转录
d、标记基因 检测目的基因是否导入受体细胞
们有什么(shé n me)作用？
第二十七页，共46页。
三、将目的(mùdì)基因导入受体细 胞
①农杆菌特点：易感染双子叶植物(zhíwù)和裸
子植
物，对大多数单子叶植物(zhíwù)没有
感染能力。
②原理：Ti质粒上的T---DNA可以转移到受体
细胞，并整合到受体细胞染色体的DNA上。
第二十九页，共46页。
③过三程、：目的(mùdì)基因导入受体 细胞
构建基因(jīyīn)表达转载入(体z农hu杆ǎn 菌rù)
单链DNA
DNA聚合酶
cDNA
第八页，共46页。基因组DNA(wénkù)与cDNA(wénkù)的比
小
大
无
有
无
有
某种生物(shēngwù)的 某种生物(shēngwù)的
部分基因
全部基因
可以
部分基因可以
第九页，共46页目的基因的有关信息，例如，根据基因 的核苷酸序列、基因的功能(gōngnéng)、基因 在染色体上的位置、基因的转录产物mRNA，以 及基因的表达产物蛋白质等特性来获取目的基因。
基因工程操作步骤
基因工程操作步骤1.提取目标基因2.质粒构建质粒是一种小型的DNA分子，可以被细菌细胞容纳和复制。
在基因工程中，质粒通常用作目标基因的携带体。
构建质粒的第一步是选择合适的质粒载体（如pUC19或pBR322），然后将目标基因序列与其连接。
连接的方法通常是通过PCR扩增目标基因，然后使用酶切和DNA连接酶将其插入到质粒中。
3.变性、酶切和连接在将目标基因插入到质粒中之前，通常需要对质粒和目标基因进行变性。
变性是指将核酸分子的双链断裂为单链，通常通过加热和短暂降温的方式实现。
然后，使用酶切酶对质粒和目标基因进行酶切。
酶切酶可以识别特定的DNA序列，并在其周围剪切。
通过选择合适的酶切酶，可以在目标基因和质粒中生成互补的黏性末端。
接下来，使用DNA连接酶将目标基因和质粒连接在一起。
4.转化、筛选和鉴定接下来的步骤是将构建好的质粒导入宿主细胞。
质粒可以通过热冲击、电穿孔或化学方法等引导宿主细胞进行转化。
转化成功后，利用培养基中添加特定抗生素或选择性培养基来筛选出携带目标基因的细胞。
通过筛选，可以获得大量携带目标基因的细胞。
然后，通过PCR、酶切和DNA测序等方法对携带目标基因的细胞进行鉴定，确保其目标基因的正确性和完整性。
5.表达和纯化一旦确定细胞中携带目标基因的准确性和完整性，可以开始目标基因的表达和纯化。
这通常包括选择合适的表达宿主，如E. coli、酵母或哺乳动物细胞，以及合适的表达载体。
在表达载体中，目标基因和其相应的启动子、终止子和调控元件被组装在一起，使得基因可以在宿主细胞中被转录和翻译。
然后，通过离心、柱层析、电泳等方法对表达产物进行纯化和分离。
6.功能分析和应用完成基因表达和纯化后，可以对目标基因进行功能分析和应用研究。
功能分析包括使用各种技术方法来研究目标基因的功能和调控机制，如转录、翻译、蛋白质互作和代谢途径等。
应用研究包括将目标基因进行遗传改良、农业改良、生物药物生产、疾病治疗等方面的应用。
简述基因工程的操作流程
简述基因工程的操作流程一、目的基因的获取目的基因的获取是基因工程的第一步，可以通过以下几种方法获取：1.从基因组文库中获取目的基因：通过基因组测序和文库构建，获得包含目的基因的文库，然后通过筛选和克隆化得到目的基因。
2.从cDNA文库中获取目的基因：cDNA文库是通过对特定组织或细胞的mRNA进行逆转录得到的，通过筛选和克隆化得到目的基因。
3.通过PCR技术获取目的基因：根据已知的目的基因序列，设计特异性引物，通过PCR技术扩增目的基因。
4.从生物体内直接分离目的基因：通过基因组挖掘和PCR等技术，可以直接从生物体内分离出目的基因。
二、载体的选择与构建载体是承载外源DNA片段并使其在宿主细胞内稳定遗传的元件，常用的载体有质粒、噬菌体、病毒等。
根据目的基因的特点和宿主细胞类型选择合适的载体，同时也可以对载体进行改造和优化，以适应不同的需求。
三、重组DNA的构建重组DNA是将目的基因与载体连接的过程，常用的方法有化学连接法、酶促连接法等。
根据目的基因和载体的类型，选择合适的连接方法，构建重组DNA分子。
四、重组DNA的转化转化是将重组DNA分子导入宿主细胞的过程，常用的方法有电穿孔法、脂质体法、化学转化法等。
将重组DNA分子导入宿主细胞后，通过筛选和鉴定，确定阳性克隆。
五、重组细胞的筛选与鉴定通过筛选和鉴定阳性克隆，确定目的基因是否成功导入宿主细胞并稳定遗传。
常用的筛选方法有PCR扩增、DNA测序、表型特征分析等。
同时也可以对目的基因的表达产物进行检测和分析，以确定目的基因的功能和表达水平。
六、基因表达与调控基因表达是指目的基因在宿主细胞内的转录和翻译过程，通过调控基因表达可以实现目的基因的高效表达或者特定组织器官中的表达。
常用的调控方法有启动子调控、转录因子调控、RNA干扰等。
七、基因工程菌或细胞的应用与优化根据目的基因的功能和应用领域，将基因工程菌或细胞应用于生产实践或医学研究中。
同时也可以对基因工程菌或细胞进行优化和改良，以提高其生产效率或降低成本。
简述基因工程的操作流程
简述基因工程的操作流程
基因工程操作流程一般包括以下几个步骤：
1. 确定目标基因：首先，科学家需要确定要操作的目标基因。
这可以通过已有的科研成果、文献研究和实验验证来确定。
2. 基因克隆：科学家需要将目标基因从生物细胞中提取出来，这个过程称为基因克隆。
基因克隆方法可以有多种，常用的方法包括PCR（聚合酶链式反应）、限制酶切和连接、DNA合成等。
3. 基因修饰：一旦提取到目标基因，科学家可以进行基因修饰。
这可能包括删除、插入或修改特定的基因片段。
4. 载体构建：科学家需要选择合适的载体，将目标基因插入其中，以便将其转移到目标细胞中。
这可能涉及到构建表达载体，以确保目标基因在细胞中得到高效表达。
5. 转染：将构建好的表达载体或重组质粒引入目标细胞。
转染方法可以包括化学转染、电穿孔、冷冻激发等多种技术。
6. 选择与鉴定：为了筛选出成功转染的细胞，科学家需要进行适当的选择和鉴定步骤。
常见的选择方法包括利用抗生素抑制未转染的细胞，而含有目标基因的细胞则能够生存下来。
鉴定成功转染的细胞可以通过PCR、南方杂交、蛋白质表达检测等方法。
7. 过程优化：在基因工程中，科学家可以对上述步骤进行优化，以提高基因转移的效率和目标基因的表达效果。
这可能包括改进载体构建、优化转染条件、研究目标基因的调控机制等。
基因工程操作流程可以根据实际需求和目标的不同而有所差异，但以上步骤是常见的基本流程。
整个过程需要科学家具备扎实的基因工程技术知识和实验操作能力。
原创12：1.2 基因工程的基本操作程序
目的基因的mRNA
反转录
单链DNA(cDNA)
合成
双链DNA (即目的基因)
（2）化学合成法：根据已知的氨基酸序列合成DNA
根据已知蛋白质的氨 基酸序列，推测出相应的 信使RNA序列，然后按照碱 基互补配对原则，推测出 它的结构基因的核苷酸序 列，再通过化学方法，以 单核苷酸为原料合成目的 基因。
练习
1）以下说法正确的是
（C）
A、所有的限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列
B、质粒是基因工程中唯一的运载体
C、运载体必须具备的条件之一是：具有多个限制 酶切点，以便与外源基因连接
D、基因控制的性状都能在后代表现出来
2）不属于质粒被选为基因运载体的理由是
A、能复制
（D）
B、有多个限制酶切点
C、具有标记基因
• 将目的基因导入受体细胞的原理
借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径。
目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳 定和表达的过程，称为转化。
（1）导入植物细胞 农杆菌转化法
农杆菌：感染双子叶植物和裸子植物
此外，还有基因枪法、花粉管通道法。
（2）导入动物细胞 显微注射法
（3）将目的基因导入微生物细胞
• 目的基因的提取方法从基因中获取目的基因人工合成目的基因
反转录法 化学合成法
利用聚合酶链式反应（PCR） 特异性地扩将含有某种生物不同基因的许多DNA片段,导入受体菌 的群体中储存,各个受体菌分别含:
5）基因工程是在DNA分子水平上进行设计施工的。
在基因操作的基本步骤中，不进行碱基互补配对的
步骤是
基因工程的操作步骤
质粒载体的扩 增：通过PCR 技术对质粒载 体进行扩增得 到足够数量的
质粒载体
质粒载体的纯 化：通过电泳、 离心等方法对 质粒载体进行 纯化得到纯化
的质粒载体
选择合适的病毒载体：如腺病毒、慢病毒、逆转录病毒等 设计目的基因：根据实验需求设计目的基因序列 构建重组质粒：将目的基因插入到病毒载体中形成重组质粒 包装病毒：将重组质粒转染到包装细胞中包装成病毒颗粒 纯化病毒：通过离心、过滤等方法纯化病毒颗粒 鉴定病毒：通过PCR、Western blot等方法鉴定病毒颗粒中的
基因工程的操作步骤
汇报人：
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基因工程简介
目的基因的获取
基因克隆载体构建
目的基因与载体连 接
将目的基因导入受 体细胞
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基因工程简介
基因工程是一种通过改变生物体的遗传物质以实现特定目的的技术。 基因工程包括基因克隆、基因表达、基因沉默等操作。 基因工程可以应用于医学、农业、环境等领域。 基因工程可以改变生物体的性状提高生物体的抗病性、抗虫性等。
转化：细菌、酵母、真、动物细胞 等真核细胞
转化：将目的基因直接导入受 体细胞使其表达
转导：将目的基因通过载体导 入受体细胞使其表达
转化方法：电穿孔法、化学转 化法、生物转化法等
转导方法：病毒转导、细菌转 导、植物转导等
转化效率：取决于目的基因的性质、受体细胞的类型和培养条件
转化：将连接好的目的基因 和载体导入受体细胞
筛选：通过抗性基因筛选出 含有目的基因的受体细胞
限制性内切酶：切割目的基 因和载体形成粘性末端
鉴定：通过PCR、测序等方法 鉴定目的基因是否成功插入到
载体中
检测目的基因是否成功插入载体 鉴定目的基因是否正确表达 检测目的基因是否具有功能 鉴定目的基因是否稳定遗传
简述基因工程的操作过程
简述基因工程的操作过程
基因工程的操作过程可以概括为以下几个步骤:
1. 质粒构建:质粒是一段小型DNA序列,可以携带DNA片段、蛋白质、酶和其他分子。
质粒的构建需要将DNA序列切割成适当大小的片段,并将其插入到载体的DNA序列中,以便将目标基因导入到细胞中。
2. 基因导入:将质粒导入目标细胞中的过程称为基因导入。
可以使用细胞转化技术,如转录因子介导的转化、PCR扩增、病毒载体等方法将质粒导入目标细胞中。
3. 表达检测:导入目标基因的细胞中,需要将基因表达进行检测。
可以使用不同的检测方法,如荧光定量PCR、Western blot、生物信息学等方法,来确定目标基因的表达水平。
4. 基因调控:基因工程还可以用于调节基因表达。
可以通过转录因子介导的调节、RNA结合蛋白介导的调节、蛋白质相互作用等因素来调节目标基因的表达。
5. 产品合成:最后一步是生产基因产品。
可以使用已经表达好的基因片段,也可以合成新的基因片段。
这些基因产品可以用于生物制药、生物燃料、生物传感器、生物医学研究等方面。
除了上述步骤,基因工程还包括其他一些操作,如基因敲除、基因编辑、基因修饰等。
这些操作都有不同的目的和应用场景,需要根据具体需求进行选择。
基因工程的发展已经深刻地改变了生物学和医学领域,为人类健康和社会发展做出了重要贡献。
随着技术的不断发展和创新,未来基因工程将带来更多的应用前景。
基因工程操作步骤
基因工程操作步骤基因工程是一种通过改变生物体的遗传物质（DNA）来改变其性状的技术。
下面是基因工程的操作步骤：1.选择目标基因：首先需要确定要改变的目标基因，以及理想中的改变效果。
目标基因可以来自不同的生物体，其中包括人类、动物、植物和微生物等。
2.克隆目标基因：将目标基因扩增出来，以便后续的操作。
常用的方法是聚合酶链式反应（PCR）。
3.构建载体：选择适当的载体，如质粒、病毒或其他载体，将目标基因插入其中。
载体是基因工程的重要工具，可以帮助将目标基因引入到目标生物体中。
4.转化目标生物体：将构建好的载体转化到目标生物体中。
这可以通过多种方法实现，如化学方法、电穿孔、冷冻、注射或基因枪等。
5.识别转化体：经过转化后，需要对转化体进行筛选和识别，以确定是否成功引入了目标基因。
这可以通过检测目标基因的表达或特定的标记物等方式进行。
6.表达目标基因：成功转化的生物体中，目标基因应该被正常地表达出来。
这意味着目标基因的DNA序列应被转录成RNA，然后进一步被翻译成蛋白质。
7.分离目标产品：如果目标基因编码的是其中一种蛋白质，可以通过分离和纯化的方法获取纯度较高的蛋白质产品。
这可以通过蛋白质层析、电泳等技术来实现。
8.分析目标产品：对目标产品进行分析和检测，以确保其质量和功能。
这可以使用多种方法，如质谱、免疫检测、活性测定等。
9.应用目标产品：根据目标产品的性质和用途，将其应用在相应的领域。
基因工程的应用非常广泛，包括生物制药、农业、环境监测等。
10.后续监测：对应用后的生物体或产品进行监测和评估。
这可以包括长期的安全性评估、产量和质量监控、环境影响评估等。
需要注意的是，在进行基因工程操作时，需要遵循一系列的伦理规范和法律法规。
此外，基因工程是一个复杂的过程，需要多学科的合作和专业知识，因此在实际操作中需要谨慎和耐心。
基因工程的操作过程
基因工程的操作过程一、概述基因工程是利用分子生物学、细胞生物学等技术对基因进行改造、合成和修饰的过程。
通过基因工程，可以实现对生物体的遗传信息进行精准地操作和改变，从而创造出具有特定功能或性状的新型生物体。
二、DNA提取在进行基因工程之前，需要先从目标生物体中提取出其DNA。
DNA提取是一个关键步骤，它决定了后续操作的成功率和效果。
1. 样品采集首先需要从目标生物体中采集样品。
样品可以是血液、组织、细胞等。
2. 细胞破碎将采集到的样品放入离心管中，加入裂解缓冲液并振荡破碎细胞壁使DNA释放出来。
3. DNA纯化通过离心等方法将杂质去除，使得纯化后的DNA可用于后续操作。
三、PCR扩增PCR（聚合酶链式反应）是一种利用酶的作用扩增目标DNA序列的技术。
PCR扩增可以将目标DNA序列扩增到足够多的数量，便于后续操作。
1. 反应体系准备将PCR反应体系中所需的酶、缓冲液、引物和模板DNA等混合均匀。
2. 反应条件设置根据所需扩增的DNA序列长度、GC含量等因素，设置PCR反应的温度、时间和循环次数等参数。
3. PCR扩增将反应体系放入PCR仪中进行扩增，经过若干轮循环后，可得到大量目标DNA序列。
四、限制性内切酶切割限制性内切酶是一种能够识别特定DNA序列并对其进行切割的酶。
通过使用不同的限制性内切酶，可以实现对目标DNA序列的精准切割和拼接。
1. 酶切体系准备将限制性内切酶加入到目标DNA溶液中，并加入适量的缓冲液和辅助物质。
2. 酶切条件设置根据所需的酶切位点和目标DNA序列特点，设置相应的温度、时间等条件。
3. 酶切反应进行将反应体系放入恒温水浴中进行反应，待反应结束后可得到经过精确切割后的DNA片段。
五、质粒载体构建质粒载体是一种能够在细胞内进行复制和表达的DNA分子。
通过将目标DNA序列与质粒载体进行连接，可以实现对目标基因的表达和功能调控。
1. 质粒载体准备选择适合的质粒载体，并进行线性化处理。
基因工程的操作过程
基因工程的操作过程1. 引言基因工程是一种利用生物技术手段来改变或调整生物体基因组成的过程。
它是一门交叉学科，涉及生物学、化学、计算机科学等多个领域。
基因工程的操作过程包括四个主要步骤：选择目标基因、克隆目标基因、转化和表达目标基因。
2. 选择目标基因选择目标基因是进行基因工程的第一步。
目标基因通常与所研究或应用的特定性状相关联。
例如，如果我们希望提高作物耐旱能力，我们可能会选择与胁迫响应有关的基因作为目标。
2.1 数据库和文献检索在选择目标基因之前，我们需要进行数据库和文献检索，以了解已有的相关研究成果。
这些数据库可以提供有关特定性状与哪些基因相关联的信息。
2.2 确定目标基因根据数据库和文献检索的结果，我们可以确定要选择的目标基因。
这通常涉及到筛选出与特定性状最相关或最有潜力的几个候选基因。
2.3 验证目标基因在选择目标基因之前，我们还需要进行一些实验验证。
这可以包括通过PCR扩增和测序来确认目标基因的存在和正确性。
3. 克隆目标基因克隆目标基因是进行基因工程的第二步。
克隆过程涉及到将目标基因从其源生物体中提取并插入到载体中。
3.1 DNA提取首先，我们需要从源生物体中提取目标基因的DNA。
这可以通过细胞裂解、DNA纯化和酶切等方法来实现。
3.2 插入载体接下来，我们需要将目标基因插入到一个载体中，以便进一步操作。
常用的载体包括质粒和病毒。
插入过程通常涉及到酶切、连接、转化等步骤。
3.3 转化宿主细胞一旦目标基因被插入载体中，我们需要将该载体转化到宿主细胞中。
这可以通过热激冲击、电穿孔或冷冻复苏等方法来实现。
4. 转化和表达目标基因转化和表达目标基因是进行基因工程的最后两个步骤。
在这些步骤中，我们将目标基因转化到宿主细胞中，并使其在宿主细胞中表达。
4.1 转化宿主细胞一旦目标基因被插入到载体中，我们需要将该载体转化到宿主细胞中。
这可以通过热激冲击、电穿孔或冷冻复苏等方法来实现。
4.2 筛选转化株一旦目标基因被转化到宿主细胞中，我们需要筛选出带有目标基因的转化株。
试阐述基因工程的概念及其操作过程。
试阐述基因工程的概念及其操作过程。
基因工程的概念起源于生物学，是对生物体内基因进行人为调控和转化的技术，这种调控和转化节省了改良品种的时间，从而在某种程度上改变了生物的自然属性。
研究者无需等待自然的选择过程，而是通过在必要的位置加入、删除或替换基因，创造出具有特定功能的基因。
这个技术为我们提供了改造和理解生物的强大工具，是现代生物技术发展中一项重要技术。
基因工程的操作过程包括多个步骤。
首先进行的是基因克隆，也就是将目标基因从DNA分离出来，然后通过加工使它适于其他生物体吸收。
接下来，将克隆的
基因插入载体如真核质粒或细菌质粒中，形成了重组载体或称为重组DNA，然后
把重组DNA引进宿主细胞。
进入细胞后，重组DNA将进一步经过多步骤复制，包含目标基因的质粒将在
细胞中自我复制，从而使目标基因数目大量增加。
此时，细胞内的目标基因将开始表达，即生成赋予细胞新特性的蛋白质，这就完成了基因的工程改造。
总结一下，基因工程是一项对生物基因进行人为调控和改造的技术，利用它可以改变生物的自然属性。
其操作过程主要包括基因克隆，将基因加工使其适合宿主生物体，引入重组DNA，以及使目标基因在细胞内进行大量复制和表达等步骤。
这个过程不仅节省了品种改良的时间，还有效改变了生物的自然属性，为生物技术的发展提供了极大的便利。
如今，基因工程已经成为生物技术领域中的重要研究方向，对人类生活产生了深远影响。
基因工程操作步骤
基因工程操作步骤
基因工程是一种利用分子生物学技术对基因进行修改或操作的科学技术，包括四个主要步骤：DNA提取、DNA插入、细胞转化和筛选鉴定。
第一步：DNA提取
DNA提取是从细胞中分离出目标基因的第一步。
首先需要选择合适的来源，比如细菌、动物、植物等。
然后通过处理，如破碎、溶解等，使细胞内的DNA被释放出来，经过纯化和分离，得到纯净的DNA。
第二步：DNA插入
DNA插入是将目标基因插入到宿主细胞中的过程。
将目标基因与载体DNA连接，然后利用特定的酶（如限制酶）进行切割，使其与宿主细胞的某个位点相连。
将该DNA带入细胞内，使其成为宿主细胞的一部分。
第三步：细胞转化
细胞转化是将DNA插入到宿主细胞后，使宿主细胞接受和表达目标基因的过程。
目前流行的转化方法有三种：自然转化、化学转化和电转化。
其中，电转化是最常用的方法，它利用高压电脉冲对细胞进行短暂的电击，使其膜通透性增加，从
而使DNA进入细胞内。
第四步：筛选鉴定
筛选鉴定是用于鉴别宿主细胞是否成功接受和表达目标基因的过程。
利用限制酶切割、PCR扩增、Southern blotting等技术方法，可以检测宿主细胞是否带有目标基因；同时，也可以通过观察目标基因是否表达以及表达程度的多寡，来判断宿主细胞是否成功接受和表达目标基因。
总而言之，基因工程操作步骤需要经过DNA提取、DNA插入、细胞转化和筛选鉴定四个主要步骤，每一步都需要严格控制条件和操作，以保证结果的准确性和可靠性。
基因工程的基本操作步骤
基因工程的基本操作步骤1.获得目标基因：确定所需的目标基因，可以通过从已知基因库中克隆目标基因，或者通过后续的基因特异性扩增来获得目标基因片段。
2.克隆和扩增目标基因：将获得的目标基因片段插入到载体（如质粒、病毒等）中，通过体外扩增技术（如聚合酶链式反应，PCR）增加目标基因的拷贝数目。
3.DNA测序：对扩增的目标基因进行测序，以确认其序列是否和期望的一致。
这对于进一步的克隆和分析十分重要。
4.选择适当的宿主：根据目标基因的特性，选择合适的宿主生物。
可以选择细菌、植物、动物细胞等不同的宿主。
5.转化宿主：将目标基因插入宿主细胞中，使其能够被细胞内的基因表达系统所识别和表达。
6.筛选和鉴定：对转化过的宿主进行筛选，以确定是否成功地将目标基因表达在宿主中。
这可以通过各种技术，如荧光标记、抗性筛选等进行鉴定。
7.基因表达和改造：在宿主中实现目标基因的表达，并进行必要的改造。
这包括调控基因表达水平、改变基因产物的结构和功能等操作。
8.分析和验证：对基因表达和改造的结果进行分析和验证。
这可以通过分子生物学技术、生物化学方法、功能性实验等手段来实现。
9.后续应用：根据实验目的和应用需求，对基因工程产物进行进一步的应用和开发。
这可以涉及到基因工程产品的应用领域，如医药、农业、工业等。
除了上述的基本操作步骤，基因工程还需要进行严格的实验设计、对操作过程进行质量控制和数据分析。
此外，基因工程的操作过程还需要遵守相关的伦理原则和法律法规，确保实验的安全性和合规性。
需要注意的是，基因工程是一个复杂的过程，具体的操作步骤可能因不同的实验目的、技术手段和宿主生物的选择而有所差异。
因此，在实际操作中，可能需要根据具体情况进行调整和优化。
3.2基因工程的基本操作程序
第一步：目的基因的筛选与获取
？ /////////用PCR可以扩增mRNA吗？///////// mRNA 不 可 以 直 接 扩 增 ， 需 要 将 它 逆 转 录 成 cDNA 再 进 行 扩 增 。 由
mRNA逆转录形成cDNA的过程是：第一步，逆转录酶以RNA为模板合成一 条与RNA互补的DNA链，形成RNA-DNA杂交分子；第二步，核酸酶H降解 RNA-DNA 杂 交 分 子 中 的 RNA 链 ， 使 之 变 成 单 链 DNA ； 第 三 步 ， 以 单 链 DNA为模板，在DNA聚合酶的作用下合成另一条互补的DNA链，形成双 链DNA分子，如下图所示。
第一步：目的基因的筛选与获取
3．利用PCR获取和扩增目的基因
⑴PCR概念 即聚合酶链式反应，它是一项根据DNA半保留复制的原
理，在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷
酸序列进行大量复制的技术。 ⑵ PCR反应条件
激活真核细胞和细菌的DNA聚合酶
①反应环境：缓冲溶液，提供合适的酸碱度和某些离子（如Mg2+）。
第一步：目的基因的筛选与获取
2．筛选合适的目的基因 从相关的已知结构和功能清晰的基因中进行筛选是较为有效的方法之 一。随着测序技术的发展，以及序列数据库（如GenBank）、序列比对工 具（如BLAST）等的应用，越来越多的基因的结构和功能为人们所知，这 也为科学家找到合适的目的基因提供了更多的机会和可能。
第三步：将目的基因导入受体细胞
构建好的基因表达载体需要通过一定的方式才能进入受体细胞。 1．花粉管通道法——我国科学家独创 方法一：用微量注射器将含目的基因的DNA溶液直接注入子房中。 方法二：也可以在植物受粉后的一定时间内，剪去柱头，将DNA溶液 滴加在花柱切面上，使目的基因借助花粉管通道进入胚囊。
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基因工程
华东理工大学 张惠展
基因工程
1 基因工程的基本概念 2 基因工程的基本原理 3 基因工程所需的基本条件 4 基因因工程 8 哺乳动物基因工程
9 高等植物基因工程
4 基因工程的操作过程
A DNA的体外重组（切、接） B 重组DNA分子的转化和扩增（转、增） C 转化子的筛选和鉴定（检）
同尾酶生产的粘性末端的连接
5' BclI 5' T ACTAG 5' 5' GATCA T TGATCA ACTAGT 5'
5'
GGATCC CCTAGG BamHI 5' GATCC G
GGATCC CCTAGG
5'
5'
G CCTAG 5'
退火
5' 5' T GATCC ACTAG G T GATCC ACTAG G T4-DNA ligase 5' 5' TGATCC ACTAGG GGATCA CCTAGT G GATCA CCTAG T G GATCA CCTAG T
5'
GGATCGGAATTCCGATCC CCTAGCCTTAAGGCTAGG
5'
重组率
重组率的定义
重组率 = 含有外源DNA的重组分子数 / 载体分子总数 在常规实验条件下，重组率一般为25 - 75%
重组率是衡量连接反应效率的重要指标，较高的重组率可以
大大简化DNA重组的后续操作。
重组率
提高重组率的方法
转化的原理与技术
细菌原生质体的转化
革兰氏阳性细菌（如枯草杆菌、链霉菌等）接纳外源DNA 的主要屏障是细胞壁，因而这类细菌通常采用原生质体（细胞 去壁后的形态）转化的方法转移质粒或重组DNA分子 酵母菌、霉菌、植物细胞也可用原生质体法进行转化
转化的原理与技术
细菌原生质体的转化
细菌原生质体的制备：
不同细菌的原生质体制备方法不尽相同，以链霉菌为例： 细菌需生长在高渗培养基中（如34%的蔗糖溶液，并加入甘氨 酸以增加细菌细胞壁对溶菌酶的敏感性。在制备过程中，菌体
转化的原理与技术
Ca2+诱导的完整细菌细胞的转化
大肠杆菌感受态细胞的制备： 100 ml 菌体培养至OD600 = 0.5，离心收集菌体 用10 ml 冰冷的10 mM CaCl2溶液悬浮菌体，离心 收集菌体 用1 ml 冰冷的75 mM CaCl2溶液悬浮菌体 冰浴放置12 - 24小时，备用
转化的原理与技术
5' 5'
人工粘性末端的连接 平头末端
5' G 3' C TdT C 3' G dTTP 5' G 3' C TdT C 3' G dATP
GTTTTTTTTTT 3' C C 3' TTTTTTTTTTG
G 3' AAAAAAAAAAC
CAAAAAAAAAA 3' G
退火
5' 5'
T4-DNA ligase
GCATGCCCCCC 3' C C 3' CCCCCCGTACG
退火
5'
GCATGCCCCCC G C GGGGGGACGTC
Klenow
CTGCAGGGGGG C G CCCCCCGTACG
T4-DNA ligase
5'
5'
GCATGCCCCCCTGCAG CGTACGGGGGGACGTC
CTGCAGGGGGGCATGC GACGTCCCCCCGTACG
5'
5'
5' 5'
TGATCC ACTAGG
GGATCA CCTAGT
不同粘性末端的连接
5' CTGCAG GACGTC PstI 5' CTGCA 3' G G 3' ACGTC 5' 5' GGATCC CCTAGG BamHI 5' GATCC G G CCTAG 5' GGATCC CCTAGG
TG AC
CA GT
粘性末端的更换
5' BamHI 5' GGATCC CCTAGG 5'
G CCTAG 5'
Klenow
5' GATCC G
5'
补平
5' GATCC CTAGG
5'
GGATC CCTAG 5'
T4-DNA ligase
5'
GGAATTCC CCTTAAGG
EcoR I
EcoR I linker
应始终悬浮在10.3%的蔗糖等渗溶液中。与原生质体接触的所
有器皿应保持无水无去污剂
转化的原理与技术
细菌原生质体的转化
细菌原生质体的转化：
取0.2 - 1ml的原生质体悬浮液（108-109个原生质体），加
入10 - 20 ml DNA重组连接液，同时加入含有PEG1000和Ca2+
的等渗溶液，混匀 细菌原生质体的再生： 原生质体再生的主要目的是使细菌重新长出细胞壁。再生 在特殊的固体培养基上进行，内含脯氨酸和微量元素
GCATGCCCCCC 3' C C 3' CCCCCCGTACG
G 3' GGGGGGACGTC
CTGCAGGGGGG 3' G
退火
5' 5'
GCATGCCCCCC G C GGGGGGACGTC GCATGCCCCCC G C GGGGGGACGTC
Klenow Pst I
CTGCAGGGGGG C G CCCCCCGTACG CTGCAGGGGGG C G CCCCCCGTACG
补平
5' AATTC TTAAG dGTP
补平
GGATC CCTAG 5' dCTP GGATCCCCCCC CCTAG
5'
GAATTGGGGGG AATTC GGGGGGTTAAG CTTAA
退火
BamH I 5' 5'
GAATTGGGGGGGATCC CTTAACCCCCCCTAGG
GAATTGGGGGGGATCC CTTAACCCCCCCTAGG
GTTTTTTTTTTG CAAAAAAAAAAC GTTTTTTTTTTG CAAAAAAAAAAC
加热
CAAAAAAAAAAC GTTTTTTTTTTG CAAAAAAAAAAC GTTTTTTTTTTG
S1
5' 5'
TTTTT TT TTG GT CAA AC AAAAAAA
AAAAA AA AAC CA GTT TG TTTTTTTC源自2+诱导的完整细菌细胞的转化
大肠杆菌感受态细胞的质粒转化： 取100 ml 感受态细胞，加入相当于50 ng 载体的重组 DNA连接液，混匀 冰浴放置半小时 在42℃保温 2 分钟（热脉冲） 快速将转化细胞转移至冰浴中放置1 - 2分钟 加入1 ml 新鲜培养基，于37℃培养 1 小时（扩增） 涂在合适的固体培养基平板上进行筛选
5'
退火
HO OH 5' G-A-A-T-T-C C-T-T-A-A G HO OH G A-A-T-T-C C-T-T-A-A-G
5'
重组率
提高重组率的方法
加装同聚尾末端：
5' GCATG 3' C TdT C 3' GTACG dCTP 5' G 3' ACGTC TdT G 3' GGGGGGACGTC CTGCA 3' G dGTP CTGCAGGGGGG 3' G
5'
5'
T4-DNA pol
切平
C G G C
Klenow
补平
GGATC CCTAG 5'
5'
5'
5' GATCC CTAGG
T4-DNA ligase 5' 5' CGATCC GCTAGG GGATCG CCTAGC
5' 5'
CGATCC GCTAGG
GGATCG CCTAGC
人工粘性末端的连接 5‘突出末端
4 基因工程的操作过程
切 接 转
增 检
4 基因工程的操作过程
A DNA的体外重组（切与接）
同种内切酶生产的粘性末端的连接 同尾酶生产的粘性末端的连接 不同粘性末端的连接
人工粘性末端的连接
粘性末端的更换 重组率
同种内切酶生产的粘性末端的连接
5' GAATTC CTTAAG EcoRI 5' G CTTAA 5' 5' AATTC G G CTTAA 5' 5' AATTC G GAATTC CTTAAG 5'
转化率
转化率的用途
利用转化率和重组率等参数可以帮助设计DNA重组实验规模 例如，某一DNA重组实验的重组率为20%，转化率为107/mg载体， 经切接处理后的载体转化率比天然的载体低100倍，欲获得104个 重组克隆，需投入多少载体DNA进行重组实验？ 若重组率为100%，则转化后产生104个重组克隆需要： 104 / 107 X 10 - 2 = 0.1 mg 载体DNA 考虑到实验系统的重组率为20%，所以实际投入载体应为： 0.1 / 20% = 0.5 mg 载体DNA
受体细胞不长）
转化率
转化率的定义
例如，pUC18对大肠杆菌的转化率为10 8 ，即每微克pUC18