一种新型的,高度有效的纤维蛋白溶解酶的分离纯化及表征

生物化学过程
一种从细脚拟青霉中得到的新型高效的溶栓酶的纯化和鉴定
摘要
从昆虫病原真菌细脚拟青霉分离纯化得到一种溶栓酶。

由 SDS–PAGE 和纤维素酶的纯化PTEFP 的分析证明它大约是14 kDa 的一个单一蛋白质带。

纤溶模式显示溶栓酶的α-链紧接着β链迅速水解。

溶栓酶迅速溶解了人的人血浆纤维蛋白原的Aα-链但不水解Bβ-链或γ-链,表明它是一个α-纤溶酶。

N-末端序列是 AQNIGAVVNLSPPKQ，这是不同于其他已知的纤维蛋白溶解酶。

PTEFP 在温度为35◦ C 和 pH为5.0时拥有最大的酶活力，在温度低于 40 ◦C和 pH 为5.0–8.0 之间很稳定。

钙离子增强酶活性而 Zn2 + 抑制它的酶活性。

PMSF，被确定为丝氨酸蛋白酶，能够强烈抑制纤溶活性。

在以H-D-Val-Leu-Lys-ρNA为模板时溶栓酶表现出高度的特异性，以H-D-Val-Leu-Lys-ρNA为模板的Km and Vmax值分别是 0.17mM和 59 U/ml。

1.介绍
心血管疾病是造成世界各地死亡的一个主要的原因。

由于心血管疾病的流行性预计将会对我们的社会情绪、社会和经济方面产生持续增加的影响。

血管内血栓形成，纤维蛋白在动脉聚集的后果，是造成心血管疾病的主要原因。

纤维蛋白是血凝块蛋白的主要组成部分，是借助酶凝血酶由纤维蛋白原形成的。

纤维蛋白原，糖蛋白包含两组三个多肽链。

在纤溶系统中不溶性的纤维蛋白纤维被纤维蛋白溶酶水解成纤维蛋白降解产物。

纤维蛋白溶酶是由纤溶酶原的活化剂从纤溶酶原中生成的，例如组织型纤溶酶原激活剂 (T-PA)，血管纤溶酶原激活物、血液纤溶酶原激活物、尿激酶、阿热曼因子与链激酶型纤溶酶原复杂。

通常纤维蛋白血栓的形成和纤溶在生物系统内能够很好的平衡。

然而，由于一些障碍当纤维蛋白不水解时，血栓形成，可能会发生。

心肌梗塞是这些血栓形成的最常见的现象。

目前，虽然 t 型纤溶酶原激活剂与尿激酶被常用在溶栓治疗方面，但还有他们一些大的缺点，如高成本，过敏反应，和口服时肠道内的内部出血的风险时。

因此，目前正在从不同的来源中寻找更便宜、更安全纤溶酶。

近年来，因为它的有效性和安全性蘑菇已成为溶栓剂的一个有吸引力的来源。

很多纤维蛋白溶解酶从几种食用或药用蘑菇中发现和鉴定，包括，金针菇，松口蘑，冬虫夏草和杏鲍菇。

由于鼓励使用纤溶食酶作为食物来源的优势，我们亦广泛从各种可以食用的菌中开发了纤维蛋白溶解酶的新来源例如，金针菇,C.平菇，蛹虫草和 A菌。

细脚拟青霉（也称为虫粳稻）是中国著名的药用真菌例如如蛹虫草和冬虫夏草等。

它是鳞翅目幼虫寄生真菌。

在日本中国和韩国细脚拟青霉是传统的被用于改善失血，疲劳和厌食状况的中药。

由于他们的多样的生物和药理作用细脚拟青霉的子实体结构作为药用中药而高度重视。

包括刺激免疫和抗肿瘤作用。

已经报道已从细脚拟青霉中发现像甾醇、环肽和多糖等许多生物活性的化合物。

然而，没有任何关于细脚拟青霉的纤溶蛋白的资料。

我们因此尝试从细脚拟青霉的子实体中确认溶解血栓的机理通过纯化和鉴定一种新型的纤溶酶。

2.材料和方法
2.1.材料
细脚拟青霉是真菌的DNA库中培养收集的。

（CCDMB，IUM01135），韩国仁川。

人纤维蛋白原，凝血酶、纤维蛋白溶酶、丙烯酰胺、柠檬酸一水，Trizma 碱、 Trizma 氯化氢、羧甲
基（PMSF），氯甲基酮（TLCK），抑肽酶，氯甲基 ,TPCK， EGTA，氯化钠、醋酸 ,EDTA，氯化钠与化学改性（动态）-琼脂糖凝胶 CL-6B 购自 Sigma–Aldrich （St。

路易，每周周一、美国）。

从 Invitrogen (卡尔斯巴德，CA，美国) 获得琼脂糖。

PageRulerTM 颜色蛋白标记是从 Fermentas （汉诺威，MD，美国）购买的。

葡聚糖 G-75 和CL-6B 快速流列购自 Phamacia （Uppasala，瑞典）和波罗斯总部是从应用生物系统（福斯特市 CA，美国）。

所有其他的化学品和试剂都是用于分析分级的。

2.2.纤溶酶的纯化
除非另有说明，所有的程序都在 4 ◦ C 进行。

取200克的细脚拟青霉以最大的速度保持两分钟置于均衡器中使其分布均匀。

重复冻结后和解冻，在 5000×g 4 ◦ C 匀浆离心30分钟。

上清被放入不锈钢 1-l 桶，部分浸入盐水中。

加入等量的−70 ◦C下冷藏的乙醇，不断搅拌，搅拌1 h。

在4 ◦ C ，10000×g下离心30 分钟去除沉淀的蛋白质。

用乙醇溶解的少部分放回不锈钢桶中，浓度升高，加入少量的75%的乙醇不断搅拌。

继续在4 ◦ C ，10000×g下离心1h去除沉淀的蛋白质。

将悬浊液加到羧甲基纤维素的试管中，缓冲相为柠檬酸盐和氢氧化钠的缓冲液。

以0.1 毫升/分的流量进行洗脱。

有效组分被单独收集并集中使用 Vivaspin 500。

进一步净化样品，用葡聚糖 G-75凝胶过滤将高度浓缩的组分收集起来，然后进一步用波罗斯20 HQ 离子交换柱进行净化。

在所有纯化步骤中，洗脱用 VERSAmax 酶标仪在350 nm监测。

利用纤溶测定蛋白酶活性评估如下所述。

分离纯化过程概述如下图1。

2.3.酶活性测定
蛋白酶活性是用肖 et al 描述的一种方法来衡量的，其中做了一些修改。

简单地说，就是将酶样本/份与 40ul 1%人血浆纤维蛋白原和10ul的5ul/ml凝血酶放在一起在37 ◦ C 培养10分钟。

"所有样品的吸收量和标准用微孔板读卡器在350 nm下测量。

纤维蛋白溶酶被作为一种标准。

一种酶的单位被定义为在37◦ C 时每分钟从D-Val-Leu-Lys-p-Nitroanilide 转换出的1um p-Nitroanilide 的量。

2.4.蛋白质分析
蛋白浓度测定用布拉德福德法用牛血清白蛋白作为标准的曲线。

已确定纯化酶的分子量和顺序已用SDS–PAGE和纤维蛋白酶测定出。

SDS–PAGE 的操作根据 Laemmli 的方法来进行，使用 12%聚丙烯酰胺凝胶和染色与马斯辉煌蓝色 R-250。

纤维素酶按照莱Balkwill 和和金et al的方法来做。

溶解凝胶溶液(12%)每10ml含有0.12%（w/v）的量的纤维蛋白原，去除在十二烷基硫酸钠混合时诱导产生的不溶性杂质。

凝血酶的溶液（1 U/ml）和 TEMED 添加到凝胶溶液中最终浓度分别为0.1 U/ml 和 0.028%(v/v)。

纯净的纤溶蛋白酶经电泳作用变成纤维蛋白凝胶，随后用2.5%特里顿X-100溶液冲洗，在37◦C时水浴作用一段时间。

2.5.纤溶和溶解纤维蛋白原的活性
使用阿斯楚普和Mullertz所描述的方法确定纤溶活性，只稍作修改，如下所示。

纤维蛋白琼脂糖板被制成1毫米的厚度，包含琼脂糖 1.2%、0.4%人纤维蛋白原和人凝血酶 20 U/ml。

血栓在室内温度能够承受1h。

然后，取1.0 g样本溶液小心放置到平板板上.。

将平板放在37◦C培养12小时，并测量细胞溶解的直径。

在纤维蛋白平板方法中，在水解区域能够观察到一个清晰透明区域，水解纤维蛋白纤溶的直径和它的活性效力是成正比的。

对达塔 et al 的纤溶系统稍加修改。

简单地说，10ul 的 1%人纤维蛋白原 (准备在 20 毫米 Tris–HCl (ph 值 7.5）包含0.15 M 氯化钠) 掺人凝血酶 (0.1 U）纤维蛋白血栓在室内温度能够承受1h。

形成的血块和纯化酶混合在一起并在不同的时间间隔下在37 ◦C 下培养。

生成的多肽用 7.5%凝胶的SDS–PAGE 来分析。

用纤维蛋白溶酶 (1ug)作为一个有利的控制条件。

2.6 pH值和温度.对酶活性的影响
纤溶活性酶的最适pH值在2.0–10.0 范围内。

一微克的酶溶液添加到 90ul 的10 mM glycine–HCl (pH 2.0–3.0)，10 mMcitric–NaOH (pH 4.0–6.0)、 10mnM Tris–HCl(pH 7.0–8.0)，和 10mM glycine–NaOH (pH 9.0–10.0) 缓冲区。

反应混合物在25 ◦ C 的条件下培养1 h ，酶活力的测定按照上文所述进行测定。

pH的稳定性通过测量纯化酶在pH 为2.0 到 10.0 的条件下培养了12h还剩下的酶活力可以得出。

酶活性的最适温度可以通过测定在不同温度下（20–80 ◦C）培养1h, 1.0 ug 的溶栓酶中的剩余活力90 ul的10 mM磷酸钠缓冲区（pH 5.0）。

这种酶的热稳定性也在相同的缓冲区相同的 ph 值，但在不同的温度下的不同的时间的条件下进行培养。

剩余的酶活力仍按照上面的方法进行。

2.7.对酶活性蛋白酶抑制剂与金属离子的影响
使用 CaCl2，CoCl2，ZnCl2、 MgCl2、 MnCl2研究金属离子对酶活性的影响。

将纯化酶 (1.0 ug) 在缺乏和存在 Ca2 +、 Co2 +、 Zn2 +、 Mg2 + 和 Mn2 + 等阳离子的最终浓度为1 10mM的Tris–HCl中在37 ◦ C 的条件下培养 1 h 。

每份酶溶液(10u l) 和人纤维蛋白原、凝血酶一起在 37 ◦ C 下培养10 分钟，用酶标仪测定其酶活力。

也使用 EDTA、EGTA、 PMSF、TLCK、 TPCK、和抑肽酶评估蛋白酶抑制剂的影响。

纯化酶培养前的总浓度为100 毫克／毫升 PMSF 和 TPCK、 50 毫克／毫升TLCK、 1mM EDTA 和 EGTA、的1 毫克/毫升抑肽酶在 10 mM Tris–HCl 在37 ◦ C 下培养1 h。

当每份酶溶液和人纤维蛋白原、凝血酶在37 ◦C下培养10分钟后，用酶标仪测定其酶活力。

抑制的水平用剩下的活力的百分比表示。

2.8.Amidolytic 活性的酶
Amidolytic的活力使用光谱的综合测量方法如 S-2288 (T-PA 为 H-D-Ile-Pro-Arg-pNA），发色底S-2238(H-D-Phe-Pip-Arg-pNA 的凝血酶），S-2251 (为纤维蛋白溶酶的H-D-Val-Leu-Lys-pNA），与 S-2444 (pyroGlu-甘-精氨酸-pNA 尿激酶）。

活性用混合的纯酶活力表示。

在37 ◦C时用温度调节分光光度计连续测量5 分钟后，所释放的硝基苯的量通过测量405 nm 时光度的变化。

PTEFP 的最大速度和米氏常数的测定要用不同浓度的（0.1–0.3 mM）H-D-Val-Leu-Lys-pNA 作为模板。

2.9.酶的 N-端氨基酸序列的测定
SDS–PAGE 被执行后，使用 Minitransblot electroblotting 系统使聚丙烯酰胺凝胶上纯化的酶被转移到二氟乙烯膜（PVDF）染成鲜红色S溶液。

染色部分被切除通过 Edman 自动化的方法并直接用作 N 端序列测定。

使用推导的氨基酸序列进一系列研究。

3.结果和讨论
3.1.纤溶酶的纯化
纤溶酶被纯化使用色谱的步骤结合的方法如表1中与图2.中所示。

提取第一次受到了离子色谱上羧甲基纤维素(钠)的吸附，获得活性组分（图。

2A）。

这些组分搜集并应用到动态-琼脂糖凝胶 CL-6B列上（图。

2B）。

活性组分通过凝胶过滤色谱法葡聚糖 G-75被进一步分离（图2 C)。

纤溶活性主要组分被收集并应用到波罗斯 20 HQ 离子交换柱上（图2D），产生的个主要峰值显示较强的纤溶活性。

从200 克细脚拟青霉的样品中，0.18 毫克的酶被纯化为550.7-fold， 3.8%的收率(表 1)。

纯化的酶的具体的活力为1431.81 U/mg，代表在粗提取物的基础上增加了四倍。

SDS–PAGE和纤维蛋白酶被用来验证单一酶的纯度（图3）。

纯化的酶被指定为细脚拟青霉纤溶蛋白酶（PTEFP）。

PTEFP 的分子质量被认为为14 kDa，据SDS–PAGE 和纤维素酶估计的一样（图3）。

纯化酶的分子量和从细脚拟青霉中得到的
酶的分子质量一样。

虽然细脚拟青霉是一种昆虫病原真菌和酸木瓜、蛹虫草，从细脚拟青霉细胞中得到的溶栓酶的分子质量（14 kDa）远远小于从蛹虫草得到的溶栓酶的分子质量(52 kDa)。

有趣的是，其分子重量低于目前报导的如 G. frondosa (20 kDa) , A. mellea (21 kDa) ,T. saponaceum (18.1 and 17.9 kDa), P. ostrestus (32 kDa) , F.velutipes (37 kDa) , P. fraxinea (42 kDa)。

这些数据表明PTEFP 其实是到目前为止发现的最小的真菌蛋白酶之一。

3.2.纤维蛋白溶解和溶解纤维蛋白原的活性
研究 PTEFP的水解纤溶机制，PTEFP的纤维蛋白的水解模式的分析首先利用了纤维蛋白平板法。

如图中4A所示。

、 PTEFP 形成比等量的纤维蛋白溶酶更大的溶解区，表明PTEFP 所产生的纤溶效率相对的纤维蛋白溶酶来说要大一点。

下一步，为了阐述 PTEFP的反应机制，使用 SDS-PAGE将产品被分开。

如图4B中所示。

，纯化的酶a-链紧接着b-链迅速水解。

此外，为了检查纤维蛋白原的活性，由SDS–PAGE分析得到的 PTEFP 纤维溶解的机制如图4 C中所示，PTEFP 迅速水解纤维蛋白的 Aα-链，但它不水解Bβ-链和γ-链。

值得注意的是，如上图4所示。

，PTEFP 比人的纤溶蛋白酶增强了纤溶和溶解纤维蛋白原的活性。

PTEFP 的纤维蛋白原分解模式类似于纤溶酶从蛇的毒液里得到的α-链纤维蛋白酶，优先水解纤维蛋白原的 A α-链而不是Bβ-链和γ-链。

其水解模式也类似鳗、葱、马铃薯和 Codium divaricatuam的α-纤溶酶。

此外，PTEFP似乎是直接作用纤溶代理，因为它直接的作用是直接分裂生物蛋白和纤维蛋白原而不是通过纤溶酶原激活因子例如 SK、和 tPA。

这种效果符合纤维蛋白溶解酶C.杏鲍菇，蛹虫草和链霉菌sp.CS684 。

纤溶酶的直接作用在临床上有的定的优势，例如，可以避免与血小板活化有关的纤维蛋白溶酶形成.这要优于酶临床常用纤溶酶原激活因子的现象。

最近，报道了它的直接作用对最终临床应用具很有深刻的生物化学和临床的基础性作用。

3.3.N-末端序列分析
借助Edman动化的方法，纯溶栓酶的SDS–PAGE 和 electroblotting N-端氨基酸之后的序列被分析出来。

前十五个N-末端序列被发现为 AQNIGAVVNLSPPKQ (表 2)。

这序列在氨基酸米曲霉真菌的假设性蛋白 RIB40 的酸水平表现出高度的一致性。

同样地，纯化的酶有 40%的序列与A.fumigates的丝氨酸相同。

然而，与其它纤溶酶比较则道 PTEFP德序列有很大的不同 (表 2)。

3.4.pH 值和温度对PTEFP的纤溶活性的和稳定性的影响
pH值对纤溶活性及酶的稳定性的影响图所示。

PTEFP的活性和稳定性的两者两者都受 pH 值的影响。

纯化的蛋白酶在pH值的范围为4.0–7.0时都很活跃，在pH值 5.0它的酶活最大。

尽管在高酸性和碱性环境中酶活会完全丧失，超过 60%的酶活被发现在pH值5.0–8.0的范围内稳定。

这种酶的最适 pH 值类似于 F. Fraxinea的FFP2，平菇的子实体的Pomep，AMMP从A菌，和杏鲍菇的纤溶酶。

PTEFP的最佳温度和热稳定性如图所示。

PTEFP 酶活的最适宜温度是35 ◦C。

温度低于 40 ◦C这种酶相对稳定。

然而，在50 ◦C一般就会失去活性。

在20 和 35 ◦C之间酶相对稳定，随着时间增加酶活慢慢降低。

这些结果与先前的报告时一致的。

3.5.蛋白酶抑制剂与金属离子对纤溶活性的影响
通过用不同的金属离子PTEFP在 37 ◦ C 下培养1 h 为，发现不同的金属离子对纤溶活性影响不同，汇总的结果如图所示。

PTEFP的蛋白水酶活力是大大的被 Zn2 +削弱。

相反， Ca2 + 能够增强该蛋白酶的活性。

这表明PTEFP蛋白酶活性取决于存在的二价阳离子Ca2 + 为PTEFP 提供的稳定的结构。

我们的数据有关金属离子对酶活力的影响与属于纤维蛋白溶解酶类的如F.蘑菇丝氨酸蛋白酶C.fraxinea，蛹虫草，杏鲍菇是一致的。

归类纯化酶，分析了在各种蛋白酶抑制剂存在的条件下的蛋白酶活力，例如 PMSF、 TLCK、 TPCK、抑肽酶，EDTA，
和 EGTA。

如图6B中所示。

酶的活性收到强烈PMSF的抑制作用、丝氨酸蛋白酶抑制剂的抑制。

相比之下，这种金属螯合剂 (EDTA）对蛋白酶的活性没有影响。

因此 PTEFP被认为是丝氨酸蛋白酶。

大多数蛇的毒液里得到的α-链纤维蛋白酶是毒金属蛋白酶，因此他们的活力受到EDTA的抑制。

然而，Siigur et al 报导从圆斑蝰蛇毒得到的α-链丝氨酸纤溶酶基本的性质不是酸性。

有趣的是，大多数从植物源发现的α-链纤维蛋白酶是丝氨酸蛋白酶，如从韭 ATFE-Ⅱ和 CDP 从 Codium divaricatum 。

因此 PTEFP与从植物源得到的丝氨酸α-链纤维蛋白酶具有相似属性。

3.6.Amidolytic 活力
纯化蛋白酶amidolytic活力使用几个显色底来评价例如（H-D-Val-Leu-Lys-pNA，为尿激酶 (pyroGlu-甘-精氨酸-pNA），和 S-2288 tPA 的 S-2444(H-D-Ile-Pro-Arg-PNA)。

如表3所示，PTEFP 对H-D-Val-Leu-Lys-pNA 的纤维蛋白溶酶显示出了高度特异性。

PTEFP 的对H-D-Val-Leu-Lys-pNA的米氏常数和Vmax值分别为 0.17 mM及59 U/ml。

从P杏鲍菇得到的溶栓酶还对纤维蛋白溶酶显示了较高的活性。

众所周知，重要的纤维蛋白溶解酶、 t 型纤溶酶原激活剂和纤维蛋白溶酶，是丝氨酸蛋白酶。

丝氨酸蛋白酶包含许多成员在同一环境中起作用。

赖氨酸和（或）精氨酸是常见的丝氨酸蛋白酶的位点参与凝血与纤溶系统。

这种专一性也能在从微生物中分离得到丝氨酸蛋白酶中观察到。

最后，从可以食用的和药用的细脚拟青霉的真菌子实体中得到的纤溶蛋白酶PTEFP也表现出了高度的纤溶活性。

质量生化纯化酶的功能表明它可能是新型丝氨酸型纤溶酶，基于其分子，N-端氨基酸序列、蛋白酶活性、热稳定性，和 ph 值。

此外，PTEFP是一种的接作用的溶栓酶，它在临床方面有有重要的意义。

虽然临床的结果对溶栓的应用程序是必要的，PTEFP或许能够成为溶栓药物重要的新资源。