T载体与目的基因连接

一. 重组质粒的构建T质粒载体
重组的DNA分子是在DNA连接酶的作用下，有Mg2 、ATP存在的连接缓冲系统中，将分别经酶切的载体分子与外源DNA分子进行连接。

DNA连接酶有两种：T4噬菌体DNA连接酶和大肠杆菌DNA连接酶。

两种DNA连接酶都有将两个带有相同粘性末端的DNA分子连在一起的功能，而且T4噬菌体DNA连接酶还有一种大肠杆菌DNA连接酶没有的特性，即能使两个平末端的双链DNA分子连接起来。

但这种连接的效率比粘性末端的连接率低,一般可通过提高T4噬菌体DNA连接酶浓度或增加DNA浓度来提高平末端的连接效率。

T4噬菌体DNA 连接酶催化DNA 连接反应分为3 步：首先，T4 DNA 连接酶与辅因子ATP形成酶-ATP复合物；然后,酶-ATP复合物再结合到具有5'磷酸基和3’羟基切口的DNA上，使DNA腺苷化；最后产生一个新的磷酸二酯键，把切口封起来.连接反应通常将两个不同大小的片断相连。

很多DNA聚合酶在进行PCR扩增时会在PCR产物双链DNA每条链的3’端加上一个突出的碱基A.pUCm—T载体是一种已经线性化的载体，载体每条链的3’端带有一个突出的T。

这样，pUCm-T载体的两端就可以和PCR产物的两端进行正确的AT配对,在连接酶的催化下,就可以把PCR产物连接到pUCm-T载体中,形成含有目的片断的重组载体。

连接反应的温度在37℃时有利于连接酶的活性.但是在这个温度下粘末端的氢键结合是不稳定的。

因此采取折中的温度，即12—16℃，连接12—16h(过夜)，这样既可最大限度地发挥连接酶的活性，又兼顾到短暂配对结构的稳定.
二. 感受态制备原理
低渗溶液中胀成球形，丢失部分膜蛋白,成为容易吸细菌在0°C CaCl
2
收外源DNA的感受态。

三. β—半乳糖甘酶显色反应选择法
LacZ基因是大肠杆菌乳糖操纵子中的一个基因,可以编码β—半乳糖核苷酶。

β—半乳糖核苷酶是由4个亚基组成的四聚体，可催化乳糖的水解．用X—Gal为底物进行染色时,呈蓝色。

现在一些特定的质粒（比如pUC/pBS等)，常带有β—半乳糖核苷酶的调控序列和β—半乳糖核苷酶N端146个氨基酸（α肽段）的编码序列,在这个编码序列里还插入一个多克隆位点（MCS），它并不影响lacZ的表达。

另外，常用的大肠杆菌带有β—半乳糖核苷酶C端部分序列（β肽段）,的编码序列.在各自独立的情况下，这些质粒与大肠杆菌各自编码的β—半乳糖核苷酶片段都没有酶的活性。

只有当携带α肽编码信息的克隆载体成功进入宿主细胞，在培养基诱导物IPTG的诱导下，载体质粒能够合成β—半乳糖核苷酶N端（α肽段），这样就与宿主细胞合成的β—半乳糖核苷酶C端部分序列（β肽段）互补，形成完整的β—半乳糖核苷酶活性蛋白。

而当外源基因插入到此种载体质粒lacZ的多克隆位点后，会造成lacZ基因不能表达,从而不能合成β—半乳糖核苷酶；而对于空载体，lacZ基因正常表达，通过α
(一).目的基因片段与载体连接
器材
旋涡混合器，微量移液取样器，移液器吸头，1.5ml 微量离心管，双
面离心管架，台式离心机，干式恒温气浴。

试剂
T 载体，T4 DNA 连接酶,连接酶缓冲液，无菌dd Water .
操作步骤
PCR产物与T载体直接连接:
(1）事先将干式恒温仪（或冰盒里的水）温度设定在14～16°C.
(2) 取4个灭菌的200ul微量离心管，加入：（需要调整） 4ml 目的基因；1ml T载体；0。

5ml T4 DNA连接酶(TAKARA， 350U/ul）；1ml 连接酶缓冲液10 x buffer ；3。

5 ml dd Water ，总量10ml 体系.
（3）述混合液轻轻震荡后再短暂离心，然后置于14°C干式恒温仪（或14°C
水中）中保温过夜（12-16h)。

（4）连接后的产物可以立即用来转化感受态细胞或置4°C冰箱备用。

（二). 大肠杆菌感受态细胞的制备细菌转化
仪器：旋涡混合器，微量移液取样器,移液器吸头，50ml 微量离心管，1。

5ml 微量离心管，台式冷冻离心机，制冰机，恒温摇床，分光光度计,
超净工作台,恒温培养箱，摇菌试管，三角烧瓶，接种环，恒温摇床，培养皿（已铺好固体LB—Amp），酒精灯,玻璃涂棒，恒温培养箱，滤膜和过滤
器
试剂:E. coli菌种，LB培养基，0.1 mol/L CaCl2溶液，无菌dd Water ，LB培养基（不加抗菌素），LB培养基（加抗菌素），无菌dd water，IPTG，X-gal。

步骤（1）在超净工作台中，将1ml大肠杆菌菌液加入100ml LB液态培养基（不含
抗菌素），37℃摇床培养过夜。

(2）取0。

5ml上述菌液转接到含有50mL LB培养基的三角烧瓶中，37℃下
250r/min摇床培养2～3h，测定OD590为0.35～0。

4左右（<0。

4~0。

6，细胞数〈108/mL，此为关键参数！）。

(注意：此步摇菌的时候，要有一管不加菌的LB培养液同时摇菌) （3) 将1ml菌液加入到4支1.5mL预冷无菌的聚丙烯离心管中，于冰上放置
10min，然后于4℃，5000rpm离心5min。

（4）将离心管倒置以倒尽上清液，加入1ml 冰冷的0.1 mol/L CaCl2溶液，
立即在涡旋混合器上混匀，插入冰中放置30min。

（5) 4℃，5000rpm离心5min,弃上清液后，用100μL 冰冷的0.1 mol/L CaCl2溶液垂悬，插入冰中放置2h,可以直接用作转化实验，或立即放入-4摄氏度冰柜中保藏.
(6) 事先将恒温水浴的温度调到42℃。

(7）从—70℃超低温冰柜中取出一管（100μL）感受态菌，立即用手指加温融化后插入冰上，冰浴5～10min.
(8) 加入5μL连接好的质粒混合液(DNA含量不超过100ng），轻轻震荡后放置冰上20min。

(9）轻轻摇匀后插入42℃水浴中90s进行热休克，然后迅速放回冰中，静置3min。

（10) 在超净工作台中向上述各管中分别加入300μL LB培养基（不含抗菌素)轻轻混匀，然后固定到摇床的弹簧架上37℃震荡1h.
（11）在超净工作台中取上述转化混合液200μL,分别滴到含合适抗菌素（Amp 100ug/L）的固体LB平板培养皿中，再在平板上滴加40μL 20mg/ml X-gal，7μL 200mg/ml IPTG,用酒精灯烧过的玻璃涂布棒涂布均匀(注意:一个不含抗生素作为对照组，玻璃涂布棒上的酒精熄灭后稍等片刻,待其冷却后再涂,菌液涂皿操作时,应避免反复来回涂布，因为感受态细菌的细胞壁有了变化，过多的机械挤压涂布会使细胞破裂，影响转化率。

)。

（12）在涂好的培养皿上做上标记，先放置在37℃恒温培养箱中30min直到表面的液体都渗透到培养基里后，再倒置过来放入37℃恒温培养箱过夜。

（13）在被细菌污染的桌面上喷洒70%乙醇，擦干桌面。

（14) 观察平板上长出的菌落克隆，以菌落之间能互相分开为好.注意白色菌斑。

（三）. 转化克隆的筛选和鉴定
器材旋涡混合器，小镊子，微量移液取样器，移液器吸头，1.5ml 微量离心管,双面离心管架，干式恒温气浴（或恒温水浴锅），制冰机，恒温摇床，超净工作台，酒精灯，无菌牙签，摇菌管。

试剂LB培养基(加抗菌素)，PCR用试剂，引物，质粒提取用试剂，酶切需要的限制性内且酶及其缓冲液，65％甘油（65％甘油，0.1mol/L MgSO4，0.025mol/L Tris Cl pH8。

0).
操作步骤方法一:快速PCR筛选法
(1）在转化的平板培养基上随机选取4个边缘清晰的白色菌落，并用记号笔在其所在的培养皿底部玻璃背面画圈做标记编号。

（2）在0.2ml PCR 微量离心管中配制25μl反应体系。

dd water 16μl
10×PCR buffer（不含MgCl2）2。

5μl
25mM MgCl2 1.5μl
2.5mmol/L dNTP 2μl（每种dNTP终浓度0.2mM）
10μmol/L Primer1 1μl(12.5—25pmoles）
10μmol/L primer2 1μl（12.5-25pmoles）
模板质粒用小tip头轻轻粘一下选中的白色菌落，再伸入PCR混合液中洗一洗Taq酶 0.5μl(1.5u）
总体积 25μl
（2)根据厂商的操作手册设置PCR仪的循环程序（本实验室已经设置为WZ): ①94℃5min ②94℃1min ③60℃1min ④72℃1min50s⑤goto②29 times ⑥72℃10min （2) PCR结束后,取10μl产物进行琼脂糖凝胶电泳(与原始插入片断同时比对)。

观察胶上是否有预计的主要产物带。

（3）按照编号找到培养皿中的原菌斑。

根据需要进行放大培养提取其质粒
（4）提取到的质粒与原先的空载体（或已知分子量的质粒）再对比电泳，以进一步确认。

方法二：提质粒再PCR或酶切鉴定
（1)在超净工作台中取3支无菌摇菌管,各加入3mL LB(含50mg/mL氨苄青霉素），用记号笔写好编号.
（2）在超净工作台中将70%乙醇浸泡的小镊子头用酒精灯烤过，镊取一支无菌牙签。

用牙签的尖部接触转化的平板培养基上的一个白色菌落，然后将牙签放入盛有3mL LB（含50mg/mL氨苄青霉素)的摇菌管中。

用此法随机取3个白色菌落，分别装入3个摇菌管中。

（3)37℃摇菌过夜后，用碱裂解法分别提取质粒。

摇菌管中的剩余菌液保留在4℃冰箱中。

（4）提取到的3管质粒样品可用PCR法扩增,或用酶切电泳法来鉴定其上是否含有外源插入片断（方法见有关实验）。

（5）将经过鉴定判断为正确的质粒保存。

按照编号找到冰箱中原菌液。

根据需要进行放大培养提取其质粒或进行诱导表达,或取500mL菌液与500mL 65%甘油混合后-80℃保存.
（6）在被细菌污染的桌面上喷洒70％乙醇，擦干桌面。