伊犁马LTF基因多态性与产奶量相关性分析

伊犁马LTF基因多态性与产奶量相关性分析
杨坤;高源;邬明丽;蓝贤勇;雷初朝;陈宏;刘武军;党瑞华
【摘要】本试验以研究伊犁马乳铁转运蛋白(lactotransferrin,LTF)基因多态性及其与泌乳性状的关系为目标,针对伊犁马LTF基因外显子和启动子设计了17对引物,以伊犁马DNA为模板,通过PCR扩增及PCR-RFLP法检测224匹伊犁马LTF 基因多态性,并与其中73匹有产奶量记录的伊犁马进行关联分析,研究该基因多态性与泌乳性状之间的关系.结果显示,在伊犁马LTF基因中检测到1个SNP:c.173 G ＞A,该SNP位点是发生在CDS区上的错义突变,致LTF编码蛋白第58位精氨酸突变为赖氨酸.与其120 d日均产奶量进行关联分析,结果显示,虽然该位点不同基因型个体的日均产奶量差异并不显著(P＞0.05),但可以发现各基因型的产奶量GG＞GA ＞AA,由此可为中国乳用马的选育提供一定的参考.%This study was to study the relationship between lactotransfferrin (LTF) gene polymorphism and its relationship with lactation.17 pairs of primers were designed for exon and promoter of Yili horse LTF gene.DNA hybrid pool was used as template and PCR product was directly sequenced.PCR-RFLP method was used to detect the expression of LTF (lactotransfferrin) gene polymorphic genotype of 224 Yili horse,and analyzed the relationship between them and lactation traits based on 73 of them.The results showed one SNP was detected in the Yili horse LTF gene:c.173 G＞A,which was a missense mutation that occurred in the CDS.It can induce fifty-eighth amino acid of LTF protein mutating from arginine to lysine.Association analysis between SNP site and daily milk yield of 120d was conducted.The resuits showed that although the milk yield of each genotype was not significantly different (P＞0.05),it
was found the milk production of each genotype being GG＞GA＞AA.The results can provide an identifiable ground for the Chinese dairy horse breeding efficiently.
【期刊名称】《家畜生态学报》
【年(卷),期】2018(039)003
【总页数】5页(P24-28)
【关键词】LTF基因;产奶量;多态性;伊犁马
【作者】杨坤;高源;邬明丽;蓝贤勇;雷初朝;陈宏;刘武军;党瑞华
【作者单位】西北农林科技大学动物科技学院,陕西杨凌712100;西北农林科技大学动物科技学院,陕西杨凌712100;西北农林科技大学动物科技学院,陕西杨凌712100;西北农林科技大学动物科技学院,陕西杨凌712100;西北农林科技大学动物科技学院,陕西杨凌712100;西北农林科技大学动物科技学院,陕西杨凌712100;新疆农业大学动物科学学院,新疆乌鲁木齐830052;西北农林科技大学动物科技学院,陕西杨凌712100
【正文语种】中文
【中图分类】S811.5
马奶的营养价值高且易消化吸收，各种成分与人乳相近，是一种比较理想的饮用食品[1]。

自古以来在新疆地区的少数民族就有饮用酸马奶的习惯，且酸马奶可做药用。

随着人民生活水平的不断提高，马奶产品以其独特的营养特性和保健特性正被越来越多的人们所接受。

随着马奶的需求日益增多，发展马乳产业存在很大潜力
[2]。

乳铁转运蛋白(lactotransferrin，LTF)也称为乳铁蛋白(lactoferrin，LF)，是一类
具有抗菌和免疫调节特性的糖原，属于转铁蛋白家族，在各种分泌物和组织中均有表达[3]。

乳铁转运蛋白以其广谱抑菌作用著称，常被添加在食品及饲料中抗贫血、治疗乳腺疾病和增强免疫力。

婴儿奶粉中添加乳铁蛋白，能改善肠道微生物菌群、促进铁吸收、降低脂质氧化[4]，因其不易失活、功能稳定的特性，也被作为动物
饲料的绿色添加剂[5]。

此外，也有学者报道中国荷斯坦牛LTF基因上的SNPs与
日均产奶量、乳脂率等产奶性状显著相关[6]。

Pawlik等[7]发现LTF基因
c.33G>A、c.-926G>A、g.109741625A>G 3个SNPs可作为波兰荷斯坦牛泌乳性状优良标记位点，证明其可能是家畜泌乳性能相关候选基因。

目前，家马上关于LTF的研究多集中于其免疫作用，未见泌乳性状相关分析[8]。

伊犁马是我国培育的以速度快、挽力好、适应性强而著称的乘挽兼用型优良马种[9]。

中国没有专门化乳用马品种，目前，关于中国家马品种泌乳性能相关基因的
研究甚少，尚未见到对伊犁马产奶性能育种值估计和评价的相关报道[10]。

本试验初步研究了伊犁马LTF基因CDS区SNP多态，并将发现的SNP位点与其日均产奶量进行关联分析，筛查了与泌乳性能相关的多态位点，为中国乳用马的高效选育、种质资源保存与利用提供一定的依据。

1 材料与方法
1.1 试验材料
1.1.1 试验用马试验所用的马匹全部来自新疆伊犁昭苏马场，放牧、饲养和管
理条件相同，年龄(约为5～6岁)、胎次(3～4胎)及产驹时间相近的伊犁马成年母
马共224匹，其中有产奶记录的73匹。

1.1.2 主要试剂琼脂糖、丙烯酰胺、血液基因组DNA提取试剂盒、核酸染料、DL50 Marker、DL2000 Marker、Mixture、双蒸水、TBE缓冲液等。

1.1.3 引物设计合成根据NCBI上家马LTF基因序列(NC_009159)设计引物，扩增马LTF基因CDS区及启动子区域(表1)。

引物使用NCBI在线引物设计工具设计，送上海生工生物工程有限公司合成。

表1 引物序列、扩增区域、片段长度及退火温度Table 1 The primer sequence, amplified region, fragment size and annealing temperature引物名称Name引物序列(5'-3')Primers扩增区域Amplifiedregion片段长度/bpSize 退火温度/℃TmLTF-exon1-FTGAGGTCACCAAGCCCTAGAexon142359LTF-exon1-RGGTGCAGAGAGCAGGACGLTF-exon2-FGAAAACTCCGTCCCAGGGTGexon237760LTF-exon2-RAGAGTGGACTGCTCCCAACTLTF-exon3-FGAGCCTGCTGATGTCCTGAAexon327259LTF-exon3-RATCCACTCTGACTCCCCAGALTF-exon4-FGCGCAGATGCTGACCCAATAexon445860LTF-exon4-RTGTGATCCCAAAGTGGTGGCLTF-exon5-FCTGAGTCTCGGGCTCACAAGexon546560LTF-exon5-RAGTCAGCACCCTCTTTGGACLTF-exon6-FGGTCTCTGGTCAGCACTTGAexon639459LTF-exon6-RCCCTGTGGGGAACCTTGATAALTF-exon7-FTGCCTTTCTGACCCCAAGTTexon743759LTF-exon7-RTCTGTGCAGTGAGGCTACAGLTF-exon8-FCTCTTAGGTGCTTGGACCCCexon851959LTF-exon8-RGGGAGATGCAGAAGTGACCALTF-exon9-FAGGCCAAGGGAAGTCTCCAAexon949261LTF-exon9-RGGACCTGTGGGCCGCTAAGLTF-exon10-
FTTGGTGAAACCTGCTCCTGGexon1041260LTF-exon10-RCACGAGTAGGGTCGCTTGTCLTF-exon11-FTGCTCAGACAGTCTCTTCGGexon1138159LTF-exon11-RGTGGCCAGGACACAATGAGALTF-exon12-FGGGTTGCCAAAGACAGTTGCexon1241660LTF-exon12-RAACCGCTCAGTGCATCCATCLTF-exon13-FTCTGTCCTGGGCAATACAATGAexon1339960LTF-exon13-RACTGGTGCTGCCCATTAGCLTF-exon14-FCCTCCACCCCTCATGGCTTAexon1447660LTF-exon14-RACCATGTTGCATGCTGAGGTALTF-exon15-FAGAGGCCTTTGGATGGTCACexon1543560LTF-exon15-RTGTCCTCATCGAGGCTCTGTLTF-exon16-FGGGCTGATCCTGGATGGAAGexon1642060LTF-exon16-RCCTGAGGCACAGAAACGCTALTF-exon17-FGAAATGTGAGCAGGGCAAGCexon1739260LTF-exon17-RAGTCCAGCTGTACAGGTATTTGG
1.2 试验方法
1.2.1 血样采集及指标测定对73匹伊犁马分别进行颈静脉采血，5～8 mL/只，加入枸缘酸钠抗凝，-80 ℃保存备用，并记录统计其120 d产奶量。

1.2.2 基因组DNA的提取采用血液基因组DNA提取试剂盒提取DNA，用核
酸蛋白测定仪测定浓度，-20 ℃保存备用。

从所采集样品中选取个体差异较大的个体构建DNA池[11]。

1.2.3 DNA池PCR扩增利用构建的DNA池进行PCR反应。

PCR反应体系为为25 μL：DNA模板4 μL，上下游引物各1 μL，2×Taq PCR Master Mix 12.5
μL，双蒸水6.5 μL。

PCR反应条件：95 ℃预变性5 min，94 ℃变性40 s，60 ℃退火40 s，72 ℃延伸60 s，35个循环；72 ℃延伸10 min；4 ℃保存备用。

PCR产物经1%琼脂糖
凝胶电泳检测。

1.2.4 直接测序及BLAST检测选取特异性好、产量高的PCR产物送西安擎科
泽西生物科技有限责任公司测序。

利用DNASTAR 7.1软件中的SeqMan程序对
测序结果进行校正和BLAST分析确定SNPs。

1.2.5 PCR-RFLP分析根据发现的LTF基因SNP位点，使用WatCut限制性内切酶在线工具网站(http://watcut.uwaterloo.ca/template.php?act=snp_new)分析并选择合适的限制性内切酶，使用NCBI在线引物设计网站设计酶切引物，扩增伊犁马LTF相关基因SNP位点。

PCR反应体系为12.5 μL，包括：DNA模板0.5 μL，上下游引物各0.5 μL，
2×TaqPCR Master Mix 6.25 μL，双蒸水4.75 μL。

PCR反应条件：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s：60 ℃退火30 s，72 ℃延
伸30 s，35个循环；72 ℃延伸10 min；最后4 ℃保存.
获得的PCR产物与相应的限制性内切酶进行酶切，酶切体系为5 μL PCR产物、9 μL ddH2O、2 μL buffer缓冲液、3 μL限制性内切酶，混匀后37 ℃消化过夜，1%琼脂糖凝胶或10%聚丙烯酰胺胶电泳检测酶切片段，凝胶成像系统观察并用Excel 记录分型结果。

1.3 数据处理分析
1.3.1 伊犁马产奶数据采集根据伊犁马生理特点，分别在一天的12、14、16、18时挤奶，称量并记录120 d内每匹伊犁马的产奶量。

用萨伊金公式计算母马日均产奶量，方法如下：
W=G×24/h(W：一昼夜产奶量；G：12 h挤出的全部奶量；h：挤奶时间总和)
泌乳期短于120 d的校正到120 d，超过120 d的截止至120 d的产奶量，校正公式如下：
120 d校正产奶量=实际产奶量×实际产奶天数对应的校正系数
使用Excel对产奶量数据进行整理。

1.3.2 伊犁马LTF基因多态与日均产奶量关联分析使用SPSS 19.0软件对伊犁
马日均产奶量与SNP多态性进行单因素方差分析(ANOVA)，分析LTF基因多态性与伊犁马日均产奶量的相关性。

2 结果与分析
2.1 PCR产物检测结果
部分1%的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物结果见图1。

从图1以看出，特征性扩
增良好，片段整齐、单一无拖尾，目的片段长度与预期结果相符，可直接用于后续分析。

2.2 PCR产物序列分析
选取扩增较好的DNA池PCR产物送西安擎科泽西生物科技有限责任公司进行测序，对测序结果应用DNA Star软件中的Meg Align和Seq Man程序进行组装、拼接。

比较发现，在伊犁马LTF基因第二外显子中检测到一个SNP位点：c.173 G>A。

DNA池测序结果见图2。

图1 部分LTF基因引物PCR扩增结果M. Marker DL2000;1-4. PCR产物；a. Exon 2;b. Exon 3Fig.1 The partial electrophoretogram for PCR of LTF geneM. Marker DL2000;1-4. PCR product;a. Exon 2;b. Exon 3
2.3 伊犁马LTF的PCR-RFLP分析结果及群体遗传结构分析
根据测序结果，使用PCR-RFLP法对224匹伊犁马样品的SNP位点进行分型，选用XmnⅠ内切酶进行酶切，分型结果如图3所示。

根据酶切结果统计样本基因型，
对LTF基因多态位点的杂合度
图2 DNA池测序结果Fig.2 The results of DNA pool sequencing (He)、有效等位基因数(Ne)和多态信息含量(PIC)进行分析，进行哈代-温伯格平衡检测，结果如表2所示。

根据Botstein多态信息含量分类标准，PIC>0.5为高度多态性位点，0.5>PIC>0.25为中度多态性位点，PIC<0.25为低度多态性位点。

由表可见，所检测的位点属于中度多态，且不满足哈代-温伯格平衡。

LTF基因的优势等位基因型为GA，优势等位基因为G，多态信息含量为0.37。

2.4 伊犁马泌乳相关基因多态性与日均产奶量关联分析
选择胎次和年龄相近的73匹伊犁马母马，记录统计其日均产奶量及该SNP位点基因型数据。

使用IBM SPSS Statistics 19将其泌乳数据与该位点的基因型进行单因素方差分析，分析结果见表3。

从表3中可见，该位点与伊犁马日均产奶量之间不存在显著相关。

图3 伊犁马LTF基因PCR-RFLP分型电泳图Fig.3 The electrophoretogram for PCR of Yili equine LTF geneM. Marker DL2000表2 伊犁马LTF基因型频率、等位基因频率及群体遗传特性Table 2 Genotype frequency, allele frequency and population genetic characteristics of LTF gene in Yili equine 基因型Genotype样本数Number基因型频率Genotypefrequency等位基因Allele等位基因频率Allelefrequency有效等位基因Ne杂合度He多态信息含量PICχ2GG360.16G0.571.96109.990.3796.01AA60.03A0.43GA1820.81
注：df=2，χ20.05(2)=5.99，χ20.01(2)=9.21，PIC>0.5为高度多态，
0.25<PIC<0.5为中度多态，PIC<0.25为低度多态。

Note：df=2，χ20.05(2)=5.99，χ20.01(2)=9.21，PIC>0.5 for highly polymorphic，0.25<PIC<0.5 for moderate polymorphic，PIC<0.25 for low
polymorphic.
3 讨论
本研究分析了伊犁马品种LTF基因的外显子及启动子序列，并将发现的多态与伊犁马日均产奶量进行了关联分析。

在伊犁马LTF基因中检测到1个SNPs : c.173 G>A，该位点可致LTF蛋白第58位氨基酸由精氨酸突变为赖氨酸。

使用PCR-RFLP方法对该位点进行分型并进行群体遗传结构分析，结果显示，该位点在伊犁马群体中为中度多态且不处于哈代-温伯格平衡。

与其日均产奶量进行关联分析后发现，该位点不同基因型的日均产奶量差异不显著，但各基因型的产奶量
GG>GA>AA。

表3 伊犁马LTF基因不同基因型与日均产奶量的关联分析Table 3 Correlation analysis of different genotype and daily milk yield of LTF gene in Yili equine基因Genes基因型Genotypes个体数Number平均值±标准差AVG±stdP值P-valueGG149.02±1.82LTFGA578.94±2.120.781AA27.93±0.01注：P<0.05为差异显著，P<0.01为差异极显著。

Note：P<0.05 is significant difference，P<0.01 is extremely significant difference.
LTF具有广谱抑菌作用，与动物的免疫功能息息相关，也有学者报道LTF基因可能是家畜泌乳性能相关候选基因，但对该基因的报道仍然较少，因此该基因在群体中可能尚处于选育状态，受到选育的力度较大而处于不平衡状态。

通过对试验过程及结果分析判断，c.173 G>A位点位于LTF基因CDs区上，是错义突变，但表型差异仍然不显著，可能因为发生突变的氨基酸并不在蛋白质的活性区域上。

此外，由于满足年龄、胎次相近的马匹样本数量较少，泌乳性能数据仅有
日均产奶量一项，关联分析的结果与实际可能存在差异。

如果能得到更多性状的生产数据，进一步进行关联分析，可使结果更加可靠。

泌乳性状作为一个数量性状，它的表现不仅受基因的影响，还有环境的作用。

产奶量是一个遗传力极低的性状，常规选育并不能使其大幅度提高，分子遗传学的发展使标记辅助选择(MAS)更加便捷，而科研人员需要做的就是找到影响产奶量性状的候选基因。

目前，国内外研究发现了大量存在于外显子和内含子中的变异，而这些突变也为MAS提供了参考，但关于马泌乳性能的有效标记还没有发现。

因此我们下一步的工作便是寻找影响马产奶量的有效候选基因，为中国乳用马的高效选育、种质资源保存与利用提供了一定的依据。

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