HPLC法同时测定速效止泻胶囊中盐酸小檗碱和没食子酸的含量

HPLC法同时测定速效止泻胶囊中盐酸小檗碱和没食子酸的含量何琳，孙银华(安徽省马鞍山市药品检验所，安徽马鞍山243011)
[摘要]目的：建立以高效液相色谱法测定速效止泻胶囊中盐酸小檗碱和没食子酸含量的方法。

方法：采用SunfireTM C18 (5μm，4.6mm×150mm)色谱柱，柱温：35℃。

流动相为甲醇-乙腈-0.1%磷酸（3﹕2﹕95），采用梯度洗脱程序，流速1.0mL·min-1，进样量为20μL，检测波长：270nm。

结果：盐酸小檗碱在20.931～209.31μg·mL-1范围内呈良好的线性关系，r=1.000 0，平均回收率为100.02%，RSD=15%(n=6)。

没食子酸在13.075～130.754μg·mL-1范围内呈良好的线性关系，r=1.0000。

结论：该方法简单、快速、准确、重现性好，能够较好地控制该产品的质量。

[关键词]HPLC；速效止泻胶囊；盐酸小檗碱；没食子酸
速效止泻胶囊成分为盐酸小檗碱120mg、拳参180mg，内容物为暗黄色细粉,具有清热利湿，收敛止泻的作用。

用于赤痢、热泻,肠炎等。

原标准为《卫生部药品标准中药成方制剂》第十三册，对主成分只作鉴别，对盐酸小檗碱、拳参2组分无定量分析；国家食品药品监督管理局标准（试行）YBZ03492005、YBZ02272005、YBZ17442005，这三个标准对盐酸小檗碱和没食子酸做了薄层鉴别，盐酸小檗碱含量用HPLC法定，但这三个标准的流动相和检测波长各不相同。

拳参中的主要成分为没食子酸[1]为更好地控制其质量，笔者研究采用HPLC法同时测定本品中盐酸小檗碱和拳参中没食子酸的含量，为本品的质量评价提供了可行的方法。

1仪器与试药
色谱柱：Sunfire TM C18（5μm，4.6mm×150μm，美国Waters)；软件：Empower2数据处理系统(美国Waters)。

Jk-2200超声清洗器，功率100W，频率40kHz。

甲醇、乙腈为色谱纯（国药集团化学试剂有限公司），磷酸为分析纯。

盐酸小檗碱对照品(中国药品生物制品检定所，批号110713-200911、110713-200910)，没食子酸对照品(中国药品生物制品检定所，批号110831-200803)，速效止泻胶囊(不同的生产厂家5个批号101001、100801、100704、100503、100506)。

2色谱条件
色谱柱：SunfireTM C18（5μm，4.6 mm×150mm，柱温：35℃。

流动相为甲醇-乙腈-0.1%磷酸（3﹕2﹕95），采用梯度洗脱程序，流速1.00mL·min-1，进样量为20μL，检测波长：270nm。

理论板数按盐酸小檗碱峰计算不低于150 000。

梯度洗脱表见表1。

表1 梯度洗脱程序
时间/min 甲醇（A）乙腈（B） 0.1%磷酸（C）
0 3 2 95
5 3 7 90
7 3 17 80
9 3 22 75
13 3 17 80
15 3 7 90
20 3 2 95
3 溶液的制备
3.1 对照品溶液的制备精密称取盐酸小檗碱对照品0.026 72g和没食子酸对照品0.018 14g分别置25mL量瓶中，加50%甲醇约20mL超声20min使溶解，加50%甲醇至刻度，作为贮备液①和贮备液②。

精密量取贮备液①和贮备液②各2mL置25mL量瓶中，加50%甲醇刻度，摇匀，作为混合对照品溶液。

精密量取贮备液①和贮备液②各2mL，分别置25mL量瓶中，加50%甲醇刻度，摇匀，作为盐酸小檗碱对照品溶液和没食子酸对照品溶液。

3.2 供试品溶液的制备取本品10粒，倾出内容物，混匀，精密称取约0.1g细粉，置50mL量瓶中，加50%甲醇约40mL，超声20min，加50%甲醇至刻度，摇匀，过滤，精取续滤液2mL置25mL量瓶中，加50%甲醇至刻度，摇匀。

3.3拳参药材溶液拳参药材，研细，取粉末0.021 7g，置100mL量瓶中，加50%甲醇约60mL超声20min，加50%甲醇至刻度。

4方法学考察
4.1线性关系考察精密吸取混合对照品溶液1，2mL，分别置50mL量瓶中，加50%甲醇至刻度，2、3、5mL分别置25mL量瓶中，加50%甲醇至刻度。

按“2”项下色谱条件测定。

以浓度为横坐标，各色谱峰面积为纵坐标，线性回归，盐酸小檗碱和没食子酸的标准曲线方程及相关系数分别为：Y=69 383.157 7X+66 176.877，r=1.000 0；Y=66 519.433X+17 332.686，r=1.000 0线性范围f分别为
20.931～209.31μg·mL-1；13.075～130.754μg·mL-1。

4.2专属性试验取混合对照品溶液、拳参药材溶液和供试品溶液，按“2”项下色谱条件测定，记录色谱图，结果见图1。

在盐酸小檗和没食子酸相对应位置上未见色谱峰，方法专属性良好。

A B C
图1 混合对照品溶液（A）、供试品溶液（B）、拳参药材溶液（C）
1-没食子酸（gallic acid）；2-盐酸小檗碱（berberine hydrochloride）
4.3 精密度试验取混合对照品溶液，在上述色谱条件下，连续进样5次，以各组分峰面积分别计算，结果各组分峰面积RSD分别为：没食子酸0.77%，盐酸小檗碱0.89%（n=5）
4.4重复性试验取同一批号的样品5份，按供试品溶液制备项制备及上述色谱条件测定，结果盐酸小檗碱平均含量为标示量的97.90%，RSD为1.76% (n=5)，表明本法重复性良好。

4.5 稳定性试验精密吸取同一供试品溶液，分别于0，4，24h测定，记录峰面积，峰面积没有变化，结果表明供试品溶液在24h内稳定。

4.6加样回收率试验精密称取已知含量的样品(批号：100503、100704)6份，分别精密加入三个浓度的对照品溶液，按供试品溶液的制备方法及上述色谱条件测定。

计算回收率，结果见表2。

表2 回收率测定结果
已知样品/μg·mL-1加入量/μg·mL-1测得量/μg·mL-1回收率/% 平均回收率/%
20.913 21.109 8 43.012 4 102.34
20.913 42.219 6 63.946 1 101.28 20.913 63.329 4 83.672 5 99.32 26.751 5 21.109 8 47.865 0 100.01 26.751 5 42.219 6 67.930 4 98.49 26.751 5 63.329 4 88.905 4 98.90
100.02% RSD为1.52%
5样品含量测定
取5批样品分别按上述方法制备及色谱条件测定,以标准曲线方程计算含量，结果见表3。

表3 样品含量测定结果
批号盐酸小檗碱/mg·g-1标示量的含量/%
101001 152.07 38.02
100801 394.22 98.56
100506 345.86 86.46
100503 297.27 74.32
100704 373.95 93.49
6讨论
6.1流动相的选择经查阅相关资料[2-8]，选择甲醇-0.1%磷酸（6﹕94）为流动相，结果没食子酸在6.6min出峰，峰形良好，而盐酸小檗碱出峰在1.7min，并峰形不规则；选择乙腈-0.1%磷酸（40﹕60）为流动相，结果没食子酸在1～2min之间出两个连在一起的峰，盐酸小檗碱也在1～2min之间出两个连在一起的峰，并峰形都不规则；选乙腈-0.2mol·L-1磷酸二氢钾磷酸（35﹕65）为流动相，结果盐酸小檗碱出峰在12.6min，峰形良好，而没食子酸则在1～3min之间三个连在一起的峰，并峰形不规则；选已甲醇：乙腈-0.1%磷酸（5﹕6﹕89）为流动相，结果没食子酸在3.5min出峰，峰形良好，而盐酸小檗碱在1h内没有出峰。

经反复试验，确定本文的色谱条件，没食子酸在4.8min 出峰，盐酸小檗碱在11.8min出峰，峰形均良好。

6.2检测波长的选择采用PDA检测器，3D检测，提取色谱图及光谱图，提取没食子酸色谱峰处的光谱图，表明在273.1和271.5nm波长处有最大吸收，提取盐酸小檗碱色谱峰处的光谱图，表明在263.6和34
7.1nm波长处有最大吸收。

选择270，272和264nm波长，2D检测，三个波长同时测定，记录峰面积，比较峰面积大小，确定270nm为检测波长。

6.3提取条件的选择参考文献[1-9]综合分析，选50%甲醇超声提取，比较了超声10min、20min、30min、40min提取的色谱峰面积，结果表明在20min时已提取完全。

将混合对照品溶液（没食子酸浓度52.30μg·mL-1，盐酸小檗碱浓度83.72μg·mL-1），分别进样5，10，20，30，35，40μL，结果没食子酸在进样30μL时峰出现变形，40μL时变形更明显，进样5～20μL峰形良好，但对峰面积的线性关系没有影响（r=1.000 0）；盐酸小檗碱峰形没有变化，进样5～40μL峰形良好，浓度对峰面积的线性关系良好（r=1.000 0）。

样品测定中，在本试验的浓度下，没食子酸的峰面积很小，超出了线性范围的最低限，只有最低限峰面积的1%，不能用于含量测定。

若取量增大100倍，则杂质峰出现，与没食子酸的峰分离
不好，并且盐酸小檗碱的浓度也增大100倍，影响色谱柱寿命，两峰高相差悬殊。

1g拳参中含没食子酸2.78～4.49mg[9]，这样每粒样品中有没食子酸约0.54mg，与盐酸小檗碱相差220倍。

本试验记录了拳参药材的色谱图，结果没食子酸的峰很小。

提示速效止泻胶囊中没食子酸的测定采用更加灵敏的方法。

测定了5批样品，其中3批样品在10.8min时有一小峰，经采用PDA检测器，3D检测，提取色谱图及光谱图，并与盐酸药根碱及巴马汀对照品比较，确定此峰为盐酸药根碱。

盐酸小檗碱对照品溶液在室温放置7d时，色谱图峰形改变，上升段有拐点，而没食子酸对照品溶液在室温放置7d时色谱图峰形不改变。

参考文献：
[1]刘晓秋，李维维，华会明.拳参的化学成分研究[J].中草药，2006，37（10）：1476-1478.
[2]黄加宝，林娜，李安珍.高效液相色谱法测定拳参中没食子酸的含量[J].时珍国医国药，2007，18（8）：1909-1910.
[3]陈慕媛，黄月纯，刘东辉，等.双柏散中蒽醌、没食子酸与生物碱的含量测定[J].中药新药与临床药理，2009，20（5）：452-456.
[4]黄毅，康爱荣.高效液相色谱法测定妇康阴道泡腾片中没食子酸和盐酸小檗碱的含量[J].时珍国医国药，2005，16（11）：1095-1097.
[5]何方方.复方疮疡搽剂中没食子酸的含量测定[J].亚太传统医药，2009，5（1）：40-41.
[6]熊灿琼，王一飞，吴娟.HPLC法测定速效止泻胶囊中盐酸小檗碱和没食子酸的含量[J].中国药事，2008，22(10)：899-912.
[7]陈玲玲.高效液相色谱法测定速效止泻胶囊中盐酸小檗碱的含量[J].海峡药学，2008（20）4：60-61.
[8]龙海燕，彭飞城，姚蓉.高效液相色谱法测定复方青果颗粒中没食子酸含量[J].中南药学，2010，（8）6：416-419.
[9]刘瑞，何方奕，李磊，等.高效液相色谱法测定拳参药材中没食子酸和绿原酸的含量[J].药物分析杂志，2005，25（4）：390-393.
[作者简介]何琳，女，本科，副主任药师，电话：182****8823，E-mail：*********************。