02实验二食品中亚硝酸盐的测定

实验二食品（腊肠）中亚硝酸盐的测定
一、实验原理与目的目的要求：熟悉亚硝酸盐的化学性质和分离方法。

掌握其定性、定量分析方法。

1、知识目标：掌握腊肠中亚硝酸盐含量的测定原理及方法。

技能目标：能对腊肠中的亚硝酸盐含量进行测定。

2、（1）亚硝酸盐作用
硝酸盐和亚硝酸盐是食品添加剂中的发色剂（也称护色剂），添加后，硝酸盐在亚硝基化菌的
作用下还原成亚硝酸盐，并在肌肉中乳酸的作用下生成亚硝酸。

亚硝酸不稳定，极易分解产生亚硝
基，生成的亚硝基会很快与肌红蛋白反应生成鲜艳的、亮红色的亚硝基肌红蛋白，亚硝基肌红蛋白
遇热后，放出疏基（-SH）,变成了具有鲜红色的亚硝基血色原，从而赋予食品鲜艳的红色。

另外，
亚硝酸盐对抑制微生物增殖有一定作用，与食盐并用，可增加对细菌的抑制作用。

亚硝酸盐摄入量过多会对人体产生毒害作用。

过多地摄入亚硝酸盐会引起正常血红蛋白转变为
高铁血红蛋白，而失去携氧功能，导致组织缺氧，引起肠原性青紫症。

（2）测定原理
亚硝酸盐釆用盐酸蔡乙二胺法测定，样品经处理、沉淀蛋白质、除去脂肪后，在弱酸条件下亚
硝酸盐与对氨基苯磺酸发生重氮化以后，再与N-1-蔡基乙二胺偶合形成紫红色染料，在538 mu波
长处测定吸光度，与标准比较定量。

二、试剂与材料（亚硝酸盐的测定（依据GB/T 5009.33-2010）
1、检测原料：红肠、腊肠、榨菜、咸菜
2、试剂：除非另有规定，本方法所用试剂均为分析纯。

水为GB/T 6682-2008规定的二级水或去离子水。

①亚铁氤化钾溶液（106 g/L）：称取106.0 g亚铁氤化钾，用水溶解，并稀释至1000 mLo
②乙酸锌溶液（220 g/L）：称取220.0 g乙酸锌，先加30 mL冰醋酸溶解，用水稀释至1000 niLo
③饱和硼砂溶液（50 g/L）：称取5.0 g硼酸钠，溶于100 mL热水中，冷却后备用。

④对氨基苯磺酸溶液（4 g/L）：称取0.4 g对氨基苯磺酸，溶于100mL20% （V/V）盐酸中，
置棕色瓶中混匀，避光保存。

⑤盐酸蔡乙二胺溶液(2g/L)：称取0.2 g盐酸蔡乙二胺，溶于100 mL水中，混匀后，置棕色
瓶中，避光保存。

⑥亚硝酸钠标准溶液(200 pg/mL)：准确称取0.1000 g于110 °C〜120 °C干燥至恒重的亚硝酸钠，加水溶解移入500 mL容量瓶中，加水稀释至刻度，混匀。

⑦亚硝酸钠标准使用液(5.0pg/mL)：临用前，吸取亚硝酸钠标准溶液5.0 mL置于200 mL容量瓶中，加水稀释至刻度。

三、仪器与设备
(1)天平：感量为0.1 mg和lmg。

(2)小型绞肉机。

(3)组织捣碎机。

(4)分光光度计。

(5)恒温干燥箱
四、分析检测过程或操作方法
1试样的预处理
(1新鲜蔬菜、水果：将试样用去离子水洗净，晾干后，取可食部切碎混匀。

将切碎的样品用四分法取适量，用食物粉碎机制成匀浆备用。

如需加水应记录加水量。

(2肉类、蛋、水产及其制品：用四分法取适量或取全部，用食物粉碎机制成匀浆备用。

(3乳粉、豆奶粉、婴儿配方粉等固态乳制品(不包括干酪)：将试样装入能够容纳2倍试样体积的带盖容器中，通过反复摇晃和颠倒容器使样品充分混匀直到使试样均一化。

(4发酵乳、乳、炼乳及其他液体乳制品：通过搅拌或反复摇晃和颠倒容器使试样充分混匀。

(5干酪：取适量的样品研磨成均匀的泥浆状。

为避免水分损失，研磨过程中应避免产生过多的热量。

2、提取净化
水果、蔬菜、鱼类、肉类、蛋类及其制品等：称取5g (精确至0.01 g)经绞碎混匀的样品，置于50 mL烧杯中，加12.5 niL饱和硼砂溶液，搅拌均匀，用70 °C左右的水约300 niL 将试样洗入500 mL容量瓶中，于沸水浴中加热15 min,取出置冷水浴中冷却，并放置至室温。

一边振荡上述提取液一边加入5 mL亚铁氤化钾溶液，摇匀，再加入5 mL乙酸锌溶液，以沉淀蛋白质。

加水至刻度，摇匀，放置30 min,除去上层脂肪，上清液用滤纸过滤，弃去初滤液30 mL,滤液备用。

3、测定
吸取40.0 mL上述滤液于50 mL具塞比色管中,另吸取（0.00、0.20、0.40、0.60、0.80、
1.00、mL）（标准溶液200pg/ml ）0.25、0.5、0.75、1.0、1.25ml 亚硝酸
钠标准使用液（相当于0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、pg/ml亚硝酸钠），分别置于50 mL具塞比色管中。

向标准管和样品管中分别加入2 mL对氨基苯碱酸溶液，混匀, 静置3 nun〜5 mm后各加入1 mL盐酸蔡乙二胺溶液，加水至刻度，混匀，静置15 nun,用2 cm比色杯，以零管调节零点，于538 imi波长处测吸光度，绘制标准曲线并比较定量。

同时做试剂空白试验。

五、结果计算
亚硝酸盐（以亚硝酸钠计）的含量按下式计算：
v m xlOOO
X =—yz -----------
xlOOO
其中：
X—样品中亚硝酸盐的含量，单位为毫克每千克（mg/kg）；
m -- 样品质量，单位为克（g）;
亦—测定用样液中亚硝酸盐的质量，单位为微克（建）；
Vi——样品处理液总体积，单位为毫升（mL）；
V2——测定用样液体积，单位为毫升（mL）。

以重复性条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值表示，结果保留两位有效数字。

在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。

六、问题与思考要点说明
（1）有些肉制品颜色较深，如红烧肉，其样品经处理、沉淀蛋白质、去除脂肪并过滤后, 取滤液60mL于100 niL容量瓶中，加氢氧化铝乳液至刻度、过滤,此时滤液为无色透明。

（2）亚铁氤化钾和乙酸锌溶液作为蛋白质沉淀剂，使产生的亚铁氧化锌与蛋白质产生共沉淀。

蛋白质沉淀剂也可采用30%硫酸锌溶液。

（3）饱和硼砂的作用是提取亚硝酸盐和沉淀蛋白质。

（4）当亚硝酸盐含量较高时，过量的亚硝酸盐可将偶氮化合物氧化变成黄色。

此时可先加试剂，再滴加样品溶液，避免亚硝酸盐过量。

思考题
1.亚硝酸盐的生理意义如何？如果亚硝酸钠急性中毒，应采取什么措施？
2.如何防止亚硝酸钠中毒？
3.怎样确定分光光度计的最人吸收波长。

如果我们测定的样品是橙色，则最人吸收波长的范闱如何确定？
4.什么叫空白实验？
5.什么叫标准曲线？绘制标准曲线时应注意哪些方面？
6.在测定总铭时，使高镒酸钾还原，加入lml尿素的作用是什么？加入尿素后再滴加亚硝酸钠，紫色一直不褪，你应作何处理？
1、了解哪些食品中亚硝酸盐含量较高？亚硝酸盐有什么危害？如何产生的？
2、了解亚硝酸盐检测方法？重点掌握分光光度法如何检测？样品如何制备和处理？
3、如何查找亚硝酸盐检测标准？食品中亚硝酸盐限量标准？
4、检测亚硝酸盐时应注意什么？如何提高亚硝酸盐检测准确度？
5、
1、什么叫标准曲线？绘制标准曲线时应注意哪些方面？
2、怎样确定分光光度计的最人吸收波长。

如果我们测定的样品是橙色，则最人吸收波长的范闱如何确定?
答：实际使用时可查标准或全波段扫描，理论上可计算，七、知识链接
肉制品中亚硝酸盐的发色剂作用
1、亚硝酸盐的生理意义
在肉制品中常加入亚硝酸钠，可使肉色鲜红。

亚硝酸盐与肌肉中乳酸作用，产生游离的亚硝酸（反应1 ）, 亚硝酸不稳定，特别是在加热时将分解成NO （反应2）, NO与肌红蛋白结合形成对热稳定的亚硝基肌红蛋白（反应3）。

这是一种鲜红色化合物，故使肉制品呈鲜红色。

NOl+CHs-CH. COOH-* HNOz+CHs-CH-COO- ---------- （1）
I I
OH OH
3HNO： - H +NO_3+2NO+H：O -------- （2）
Mb+NO ----- MbNO -------- （3）
亚硝酸盐除具发色作用外，还能抑制肉毒棱状芽胞杆菌的效力。

这也是它在肉制品的保藏过程所发挥的有益作用。

因此，只要控制亚硝酸钠的加入量，它的危害是可以避免的。

人体摄入过量的亚硝酸盐，可使血红蛋白变成高铁血红蛋白，失去输氧能力，引起肠原性青紫症，中枢神经系统缺氧而受损，呼吸困难, 循环衰竭，并可造成血管扩张，血压下降。

特别是亚硝酸盐被还原成亚硝胺后，是一个已确定的致癌物质。

误食亚硝酸盐引起中毒，潜伏期很短，一般十多分钟：大量食■用青菜引起亚硝酸盐中毒，潜伏期1—3小时，甚至可达2 0小时。

中毒的主要症状是头晕、头痛、心率如速，烦躁不安，呼吸急促恶心，腹痛、腹泻等。

严重者可有心率减退，心律不齐，昏迷、惊厥，最后因呼吸衰竭而死亡。

2.急救治疗
早期应洗胃、催吐和导泻，以促使毒物尽快排出。

要及时II服或注射特效解毒剂美蓝（亚甲蓝）。

它是一种氧化剂，由于少量美蓝进入体液后，被酶还原成还原型美蓝，它使高价铁血红蛋白迅速还原成正常（低价）血红蛋白，而其本身则被氧化成美蓝。

美蓝用量小而见效快。

用药剂量一定要准确。

美蓝用量每次1 -2 mg/kg （体重），通常将10%的溶液以25-50%葡萄糖20ml棉释后，缓慢静脉注射。

美蓝也可I I服，剂量为每次3-
5mg/kg （体重），每日三次。

维生素C也是一种还原剂，但需较大剂量。

3.亚硝酸盐的预防
硝酸盐、亚硝酸盐主要来自蔬菜，在蔬菜的收获和运输过程中避免严重损伤；存放地点应干燥、通风和阴凉。

避免长时间堆放，变质菜不可出售。

在较人食用菜叶时，切碎后可先用沸水煮3-5分钟，然后烹调食用。

腌菜必须腌透，半个月以上最好。

肉制品要按规定标准加入亚硝酸盐，不可过量。

还需要指出，联合国粮食与农业组织（FAO）及世界卫生组织（WHO）,对食品添如剂早就给予高度重视。

该组织认为食■品添加剂不包扌舌残留农药，污染物质营养强化剂。

根据多年的经验及动物试验，规定了添加剂的“每口允许摄入量”，也就是说，某种化学物质一个人每天食用同样的量，长期不断地食■用下去，对人体也不会产生危害的剂量，用AD I值表示。

国际上采用安全系数定为100,即把动物试验通常所得出的最人无副作用剂量除以100, AD I值是以人的体重（kg）为基准来表示添加剂每口人体允许食用量（mg）。

下表中列出一些常见的食品添加剂的AD I值。

4、亚硝酸盐限量标准
7-1 A D I
GB 2762—2005
表食品中亚硝酸盐阻■播标
八、实验实训要求与任务
一、撰写实验报告，要求如下内容和格式:
实验项目名称：（如食品中亚硝酸盐含量的测定）
一、实验原理与目的
二、试剂与材料
三、仪器与设备
四、分析检测操作过程
五、结果与计算
六、问题与思考
二、实验前准备
1、了解哪些食品中亚硝酸盐含量较高？亚硝酸盐有什么危害？如何产生的？
2、了解亚硝酸盐检测方法？重点掌握分光光度法如何检测？样品如何制备和处理？
3、如何查找亚硝酸盐检测标准？食品中亚硝酸盐限量标准？
4、检测亚硝酸盐时应注意什么？如何提高亚硝酸盐检测准确度？
5、怎样确定分光光度计的最大吸收波长。

如果我们测定的样品是橙色，则最大吸收波长的范围如何确定？
6、什么叫空白实验？什么叫标准曲线？绘制标准曲线时应注意哪些方面？
思考问题
1、什么叫标准曲线？绘制标准曲线时应注意哪些方面？
2、怎样确定分光光度计的最人吸收波长。

如果我们测定的样品是橙色，则最人吸收波长的范闱如何确定？答：实际使用时可查标准或全波段扫描，理论上可计算，。