胰蛋白酶分离工艺

1、集落刺激因子（G-CSF ）

组成结构：是一种含有二硫键的单链糖蛋白，由175个氨基酸残基组成的单链非

糖基化多肽链

理化性质：①性状：无色澄明液体

②分子量：20000，等电点为5.8～6.6

③溶解度：

④稳定性：

生理作用与临床适应症：作用于造血祖细胞，促进其增殖和分化，其重要作用是

刺激粒、单核巨噬细胞成熟，促进成熟细胞向外周血释放，并能促进巨噬细胞及

噬酸性细胞的多种功能 ，主要用于预防和治疗肿瘤放疗或化疗后引起的白细胞

减少症， 分离纯化工艺：

G-CSF 为无菌冻干粉剂，由含有10mM 醋酸钠pH 为4的蛋白溶液经0.2um 过滤后

分装冻干。

由含有高效表达人G-CSF 的原核表达系统（E.coli ）经发酵、分离和高度纯化后

经冻干制成。

纯化液聚乙二醇浓缩洗脱液柱层析透析液透析缓冲液溶解沉淀沉淀蛋白质盐析洗脱液纤维素柱层析透析液透析

缓冲液溶解沉淀饱和度至加入硫酸铵透析液透析滤液超滤浓缩正常成人尿液150

ephadexG -%8020000 S DEAE 2、超氧化物歧化酶（SOD ）：

组成结构：

理化性质：①性状：淡蓝色冻干粉结晶体

②分子量：32000左右

③溶解度：

④稳定性：耐热性强，90℃ 环境120分钟酶活几乎没有损失，100℃环境60分

钟酶活保持90%以上；稳定性高，在pH4.0—11.0范围内酶活稳定。

生理作用与临床适应症：是一种能够催化超氧化物通过歧化反应转化为氧气和过

氧化氢的酶，是一种重要的抗氧化剂，保护暴露于氧气中的细胞

分离纯化工艺：

血液预处理,洗涤红细胞和溶血;去除大部分杂蛋白得SOD 粗品;再经柱层析分离

得到精品。猪血经血液预处理、洗涤红细胞、溶血、乙醇一氯仿混合液除去血红

蛋白，然后用坟柳043HZO 萃取、丙酮沉淀、55一65℃热变性得到粗酶液。粗酶

液上阴离子DEAE 一Cellulose52交换层析柱、分子筛SephadexG-75柱,最终获

得了纯化的铜锌超氧化物歧化酶。

冻干粉末

冻干纯化液凝胶层析洗脱液柱柱层析上清液离心透析液磷酸钾缓冲液

透析粗提液，后冰浴℃热处理重蒸水溶解沉淀离心加入预冷过的丙酮上清液离心上层液萃取加入上清液离心

仿加入预冷过的乙醇，氯溶血液细胞溶胀沉淀离心

清洗红细胞去血浆离心匀浆液草酸钾组织匀浆新鲜猪血75

52min 1565-5542l a %5.2--SphadexG Cellulose DEAE HPO K C N 3、胰蛋白酶： 组成结构：

理化性质：①性状：白色或米黄色结晶性粉末

②分子量：24000左右pI10.5

③溶解度：溶于水，不溶于乙醇、甘油、氯仿和乙醚

④稳定性：最适pH 值7.8～8.5左右pH>9.0不可逆失活 生理作用与临床适应症：本品为蛋白质水解酶，能选择地水解蛋白质中由赖氨酸

或精氨酸的羧基所构成的肽链，能消化溶解变性蛋质，对未变性的蛋白质无作用，

因此，能使脓、痰液、血凝块等分解、变稀，易于引流排除，加速创面净化，促

进肉芽组织新生，此外还有抗炎症作用。

临床上用于脓胸、血胸、外科炎症、溃疡、创伤性损伤、瘘管等所产生的局

部水肿、血肿及脓肿等。喷雾吸入，用于呼吸道疾病。也可用于治疗毒蛇咬伤。

还常用于动物细胞培养前对组织的处理。

分离纯化工艺：

鸡卵类粘蛋白是一种专一性很强的胰蛋白酶的抑制剂，对猪和牛的胰蛋白酶有很

强的抑制作用（而对胰凝乳蛋白酶无抑制作用）。在pH7.6～8.0的范围内，猪

或牛胰蛋白酶能牢固地吸附在鸡卵类粘蛋白上，在 pH2.5～3.0的范围内，能从

鸡卵类粘蛋白上被洗脱下来。因此，采用鸡卵类粘蛋白作为配基制成亲和吸附剂，

可以从胰蛋白酶粗品直接获得高纯度的胰蛋白酶。反应的基本原理如下：

纯化液浓缩透析液脱盐

透析洗脱液离子交换层析洗脱液

凝胶层析浓缩液聚乙二醇浓缩透析液透析洗脱液离子交换层析液

F SepharoseF Q Sephacryl F SepharoseF Q ---300鳀鱼粗酶 4、蚓激酶：

组成结构：

理化性质：①性状：微黄色粉末

②分子量：

③溶解度：

④稳定性：在碱性环境中则相对稳定

生理作用与临床适应症：是一种多分子重组口服制剂，与血栓（纤维蛋白）有特

殊的亲和力，能够跟踪溶栓，有效溶解微栓，改善微循环，加强心、脑血管侧支

循环，开放性修复血管受损内皮细胞，增加血管弹性，改善血管供氧功能，降低

血液粘度，降低血小板聚集率，抑制血栓再次形成。修复血栓发生后周边坏死脑

细胞，挽救半暗区。目前已广泛用于临床，并越来越多地用在心、脑血管、内分

泌，呼吸系统等疾病的预防和治疗中心。

分离纯化工艺：

（一）鲜蚓清洗 在筐中或地面上将蚯蚓上部泥土层层除去，把蚯蚓铺成薄

层，光照10～18小时，让蚯蚓排出污物，用自来水在槽中冲洗二遍，洗去泥和

粘浮物，用塑料桶装盛，贮存于冷库中备用； （二）磨浆 用胶体磨将蚯

蚓磨成浆液，蚯蚓与按（V ／V ）1∶3～5的比例加入低浓度乙醇的pH5．0～5．3

的柠檬酸钠制成匀浆； （三）除渣 用沉降离心机将料液中的粗渣去除，

制得上清液； （四）盐析 上清液中按30％饱和浓度加入硫酸铵，搅拌

完全溶解后静置1小时； （五）离心 用立式高速离心机经高速离心将料

液中细渣去除，制得清液； （六）超滤 取上清液用50，000dt 膜超滤，

得超滤液； （七）柱层析分离 将超滤液用泵送到下料桶，混合上样，上

样完毕，用洗涤液，洗至流出液呈淡黄色，pH7．0～8．0，略呈碱性，再用洗脱

液洗脱，洗脱液变混浊，颜色由黄变红，流出液电导率比洗脱液电导率略高时开

始收集，洗脱至料液变清，颜色呈淡橙色，电导率达到洗脱液电导率（不小于

9000μs ／cm ）为止； （八）超滤 将收集液倒入贮罐内，开泵，调转速

21×12rpm ，调节压力不大于0．1Mpa ，浓缩至1／15，收集料液澄清，澄清完再

上柱加去离子水脱盐，至浓缩液呈中性（pH ＝7．0）最后浓缩至1／（16～20）；

（九）过滤、除菌 用澄清型、除菌型液净滤板过滤3遍，至滤液澄清，在

30万级用0．22um 微孔滤膜进行灭菌过滤； （十）喷干 在干燥塔中，

使出口温度控制在80～86℃干燥料液，收集酶粉。

酶粉喷干滤液灭菌过滤滤液超滤脱盐

膜分离洗脱液柱层析超滤液膜超滤

膜分离上清液去除细渣离心盐析液加硫酸铵盐析上清液去除粗渣

离心匀浆乙醇溶解碎片捣碎洗净蚯蚓污物洗净光照，让蚯蚓排出预处理新鲜蚯蚓000dt ，50

纯化液

疏水色谱层析洗脱液离子交换层析洗脱液凝胶层析上清液离心粗酶液浓缩滤液脱盐超滤上清液℃

离心匀浆液匀浆碎片捣碎洗净蚯蚓污物洗净光照，让蚯蚓排出预处理新鲜蚯蚓75

k 104 SephadexG D

5、细胞色素C ：

组成结构：其肽链仅有104个氨基酸，其中赖氨酸含量较高，故为碱性蛋白。

理化性质：①性状：红色冻干粉

②分子量：11000-13000

③溶解度：易溶于水，在酸性溶液中溶解度更大

④等电点10.2-10.8，含铁量0.37-0.43%

细胞色素C 对热，酸和碱都比较稳定，但三氯乙酸和乙酸可使之变性，引起部分

失活。

生理作用与临床适应症：细胞色素C 与细胞凋亡有关，从线粒体中泄露出的细胞

色素C 有诱导细胞凋亡的作用。本品用于组织缺氧的急救和辅助用药，如一氧化

碳中毒、催眠药中毒、新生儿窒息、严重休克缺氧、麻醉及肺部疾病引起的呼吸

困难、高山缺氧、脑缺氧、心脏疾病引起的缺氧等。

分离纯化工艺：