生化实验技术》综合设计性大实验ppt课件

1．生物资料的组成成分非常复杂， 有数百种甚至更多，各种化合物的外 形、大小、相对分子质量和理化性质 都各不一样，有的迄今还是未知物， 而且这些化合物在分别时仍在不断的 代谢变化中。
2．在生物资料中，有些化合物含量很低 或极微，有的只需1／l0 000，甚至更少。制 备时，原资料用量很大，得到产品很少，与 投料量相比“虎头蛇尾〞。近年来，用所谓 “钓鱼法〞，利用某些分子特有的专注亲和 力，将某一化合物从极复杂的体系中“钓〞 出来，与其他化学分别技术相比具有很大的 优越性。
4.压破碎法
加气压或水压〔如上海高压匀浆 泵厂消费的高压匀质机〕，达20.59～ 34.32MPa
〔210 ～ 350kgf ／ cm2〕 的 压 力 时 ， 可 使90%以上细胞被压碎。多用于微生物 酶制剂的工业制备。
(三)生化及化学法
1．自溶法
即新颖的生物资料存放在一定的pH和适当温度下，利 用组织细胞中本身的酶系将细胞破坏，使细胞内含物释放 出来的方法。自溶的温度，动物资料选在0～4℃，微生物 资料那么多在室温下进展。
2．发育生长阶段
幼年动物的胸腺比较兴隆，老龄 后逐渐萎缩，因此胸腺原料必需采自 幼龄动物。
3．生物形状
动物饱食后宰杀，胰脏中的胰岛素含量添加，对 提取胰岛素有利，但胆囊收缩素的分泌使胆汁排空，对 胆汁的搜集不利。严重再生妨碍性贫血症患者尿中的EPO 〔erythropoietin,红细胞生成素〕含量添加。
原料选择和预处置
选什么样的原资料应视消费目的而定。 普通要留意以下几个方面:
1．要选择有效成分含量高的新颖资料； 2．来源丰富易得； 3．制造工艺简单易行； 4．本钱比较低； 5．经济效果要好。
如蛋白质原料的选择
蛋白质类生化产品的原料来源有动植 物组织和微生物等，原那么是要选择富含 所需蛋白质多肽成分的、易于获得和易于 提取的无害生物资料。
07级生物技术实验安排
11-14周 14-16周 15周
17周Βιβλιοθήκη 生物技术072-073班实验 生物技术071班实验 生物技术072-073班上交
论文及讨论资料等 生物技术071班上交论文
及讨论资料等
第一部分 生化物质的制备分析
普通从天然生物资料制造生化物质的过 程大体可分为六个阶段：
1.原料的选择和预处置
一、物质的性质与提取
〔一〕物质的性质与提取方法的选择
选择适宜的溶剂系统与提取条件。
〔二〕活性物质的维护措施
1．采用缓冲系统 2．添加维护剂〔半胱氨酸，复原性谷胱甘肽等〕 3．抑制水解酶的作用(SDS,EDTA) 4．其他维护措施(防止过酸过碱和猛烈搅拌 〕
〔三〕生化物质的提取
普通消费上多用2～3次提取。溶剂用 量〔L〕为生物资料的2～5倍，少数情况也 有用10～20倍量溶剂作一次性提取。目的是 节省提取时间，降低有害酶的作用。
二、影响提取的要素
〔－〕温度
〔二〕酸碱度 〔三〕盐浓度
三、提取方法
〔一〕用酸、碱、盐水溶液提取
〔二〕用外表活性剂提取 〔三〕有机溶剂提取
对酸性物质的提取，常在碱性条 件下进展；对碱性物质的提取，常在 酸性条件下进展；对两性物质的提取， 那么使水溶液的pH值在远离该两性物 质的等电点为佳。
〔三〕超临界气体的萃取技术
不同的生物体或同终身物体不同的组织，其 破碎的难易不一样，运用的方法也不完全一样。 动物的脏器组织，常用绞肉机机械法粉碎；植 物肉质组织可以磨碎；许多微生物均具有坚韧 的细胞壁，常用自溶、冷热交替、加砂研磨、 超声波、加压处置等破碎方法。
假设提取的有效成分是体液或细菌胞外某些多 肽激素、酶等，那么不需求破碎细胞。
3.外表活性剂处置法
外表活性剂的分子中，兼有 亲脂性和亲水性基团，能降低水 的界面张力，具有乳化、分散、 增溶作用。较常用的有十二烷基 硫酸钠(SDS)、氯化十二烷基吡 啶、去氧胆酸钠等。
生化物质的提取
利用一种溶剂对不同物质溶解度的差别， 从混合物中分别出一种或几种组分的过程 称为提取〔extraction〕，提取又称萃取或 抽提，其含义根本一样。用冷溶剂从固体 态物质提取的过程可称为浸渍 〔maceration〕 ； 用 热 溶 剂 者 可 称 为 浸 提 〔digestion〕，也称浸煮
<生化实验技术> 综合设计性大实验
协作性学习实验实施流程及要求
课堂实际学习：辅导相关生化大分子提取分别 纯化根本知识
工程发布：了解工程内容 网上约定：实际自学——设计实验方案——网
上递交——教师修正及审核——实验室工程实 施——论文上交——教师批阅——评分 实验分组：各自组合，最多不超越4人/组，推 选组长，担任平常讨论、工程方案设计及资料 搜集
3．许多生物活性物质，一旦分开了生物 体内环境，很易变性及被破坏，应非常留意维 护这些化合物生物的活性，常选择非常温暖的 条件，尽能够在较低温度和干净环境中进展。 普通来说制备的操作时间长、手续较繁琐。由 于许多大分子在分别过程中，过酸、过碱、重 金属离子、高温、猛烈的机械作用、剧烈的辐 射和机体内本身酶的作用，均可破坏这些分子 的构造或生理活性。
4．生化分别制备过程几乎都在溶液中进 展，各种温度、pH、离子强度等参数，对溶 液中各种组成的综合影响，经常无法固定， 有些实验或工艺的设计实际性不强，常带有 很大的阅历成分。因此，要建立反复性好的 成熟工艺，对生物资料、各种试剂及其辅助 资料等都要严厉地加以规定。
5．生化制备方法最后均一性的证明 与化学上纯度的概念并不完全一样，这 是由于生物分子对环境反响非常敏感， 构造与功能的关系比较复杂，评定其均 一性时，要经过不同角度测定，才干得 出相对“均一性〞结论，只凭一种方法 所得纯度的结论，往往是片面的，甚至 是错误的。
6.以血清球蛋白为例解释提取制备每步骤的 根本原理？
7.枯燥离子交换剂应如何进展处置？何谓 离子交换剂转型？
8.动植物总DNA或RNA提取的方法主要有哪 些？以猪脾脏DNA提取为例试述每步骤主 要原理是什么？如何判别所提取DNA的纯 度？
9.蛋白质浓度测定方法有哪些？如何鉴定 所提取蛋白的纯度？未知蛋白质分子量 测定方法有哪些？
实验实施要求：平常按各组方案时间分 别进展实验，组长有义务指点下组相关 实验内容，每次实验必需登记。
全班交流：实验终了安排课堂讨论交流， 每组预备一人汇报，一人记录；要求用 PPT总结汇报工程实施、实验创新、疑问 点，其他组学生质疑，教师点评。
指点教师：汪财生、斯越秀
实验工程训练目的
经过综合训练，可以系统掌握蛋白质、 DNA制备的根本原理和操作，学习如何 进展实验设计，掌握实验过程中的关键 环节，对实验中出现的问题进展科学的 分析；在学习实验技术的同时，自觉培 营养析问题和处理问题才干。
2.原料的粉碎；
3.提取，即从原料中经溶剂分别有效成分，制成粗 品的工艺过程；
4.纯化，即粗制品经盐析、有机溶剂沉淀、吸附、 层析、透析、超离心、膜分别、结晶等步骤进展
5.枯燥及保管；
6.废品及制剂，即半废品或原料药经精 细加工制成片剂、口服液、针剂、冻干 剂等供饮用或临床运用的各种剂型。
利用生化制备技术从生物资料中获得 特殊的生物活性物质，如蛋白质、酶、 激素、核酸等生化产品时，通常要留意 以下几个问题：
用枯草杆菌或酵母菌作宿主菌，虽可处理这 一矛盾，但表达的蛋白质成分仍有缺乏糖基 化等翻译及修饰的缺陷；用动物细胞和昆虫 细胞表达那么能比较好地处理后处置及完好 表达的问题。
用肿瘤细胞作宿主细胞制成的生化产 品还应思索到其平安性，制造体外诊断用 试剂那么是很好的高产方法。
原料的粉碎
在提取前先将大块的原料粉碎或绞碎成适用的粒度， 或将细胞破碎，使胞内生物活性物质充分释放到溶液中， 有利于提取或吸附。
以气体为萃取剂，当气体处于超越临 界温度和临界压力时，呈现一种既非液相 又非气相的流体，兼有液体和气体的特性。 如密度接近于液体，粘度却接近于气体， 具有良好的溶剂性质。
气体萃取剂必需具有临界压力低，临 界温度接近于室温，化学稳定性好，价廉 易得等特点。主要有二氧化碳、氮气、乙 烯、乙烷、丙烯、丙烷等，最常用的是二 氧化碳。其方法主要有等温法和等压法两 种，借助于压力或温度的调理分别萃取剂 与被萃取物。
思索题〔课前设疑〕
1.如何坚持生化物质的生物活性？普通生化物 质在碱性条件下容易变性，还是在酸性条件 下容易变性？
2.普通从天然生物资料制造生化物质的过程大 体可分为几个阶段？
3.在制备生化物质前应如何选择原料？
4.什么叫动态吸附和静态吸附？它们在运用 上有何区别？
5.对酸性物质的提取，常在什么条件下进展？ 对碱性物质的提取，常在什么条件下进展？ 对两性物质的提取，常在什么条件下进展？
自溶时，需加少量的防腐剂， 如甲苯、氯仿等，以防止外界细 菌的污染。因自溶的时间较长， 不易控制，故制造具有活性的核 酸、蛋白质时比较少用。
2．酶处置法
用外来酶处置生物资料，如溶菌酶〔Lysozyme〕 是专注地破坏细菌细胞壁的酶。如用噬菌体感染大 肠杆菌细胞制造DNA时，采用pH8的0.1mol／L三羟甲 基氨基甲烷〔Tris〕－0.01mol／L乙二胺四乙酸 〔EDTA〕制成每毫升含2亿个细胞的细胞悬液，然后 参与100μg— 1mg的溶菌酶，在37℃保温10min，细 菌胞壁即被破坏；还有把蜗牛酶用于酵母细胞的破 碎；用胰酶处置猪脑制备脑安素。用于专注性分解 细胞壁的酶还有纤维素酶〔破坏植物细胞〕、细菌 蛋白酶、酯酶、壳糖酶等。
该技术运用于酶、不饱和脂肪酸的 提取〔如鱼油和卵磷脂的提取〕、精制 和回收，也可用于生化产品的溶剂脱除。 某些生化产品在消费过程中，采用了丙 酮和甲醇溶剂，欲脱去溶剂又要防止产 品的分解，需选择超临界气体提取。与 减压枯燥法相比较，前者不多耗费能源， 且缩短脱溶时间。
4．原料来源
血管舒缓素可分别从猪胰脏 和猪颚下腺中提取，两者生物学 功能并无二致，而稳定性以颚下 腺来源为好，因其不含蛋白水解 酶。
5．原料解剖学部位
猪胰脏中，胰尾部分含激素较多，而胰 头部分含消化酶较多。如分别摘取那么可提 高各产品的收率。
胃膜素以采取全胃粘膜为好，胃蛋白酶 那么以采取胃底部粘膜为好，因胃底部粘膜 富含消化酶。
对天然蛋白质生化产品，为提高其质 量、产量和降低消费本钱，对原料的种属、 发育阶段、生物形状、来源、解剖部位、 生物技术产品的宿主菌或细胞都有一定的 要求，了解这些，可使分别纯化任务事半 功倍，反之那么收效甚微。
1．种属
牛 胰 含 胰 岛 素 〔insulin) 单 位 比 猪 胰 高 ， 牛 为 4000 IU ／ kg 胰 脏 ， 猪 为 3000 IU／kg胰脏。抗原性那么猪胰岛 素比牛胰岛素低，前者与人胰岛素相比， 只需1个氨基酸的差别，而牛有3个氨基 酸的差别。
2.冷热交替法
在细菌或病毒中提取蛋白质和核酸时可用此 法。操作时，将资料投入沸水中，在90℃左右维 持数分钟，立刻置于冰浴中，使之迅速冷却，绝 大部分细胞被破坏。
3．超声波处置法
多用于微生物资料，处置的效果与样品 浓度、运用频率有关。用大肠杆菌制备各种 酶时，常用50～100mg／L菌体的浓度，在 1KHz～10KHz〔千赫兹〕频率下处置10～ 15min。对于其他细菌，那么视详细情况而 定。操作中留意防止溶液中气泡的存在，制 备对超声波敏感的一些核酸、酶，要慎重运 用。
6.从简化提纯步骤着手
如从鸽肝中提取乙酰化酶，需将 动物饥饿后取材，可减少肝糖原，以 简化纯化步骤。
7．对生物技术产品宿主菌或细胞的要求
选择生物技术产品的宿主受体菌或细胞也应 思索到后处置的问题。如用大肠杆菌表达，由于 其不能将所表达的蛋白质分泌到体外，故提取时 必需破壁，添加了提取的困难，而且还能够含有 毒素类有害因子；
(一)机械法
主要经过机械力的作用，使组织粉碎。粉碎少量 原料时，可运用高速组织捣碎机〔10 000r／min〕、匀 浆器、研钵、研船等。工业消费上普通常用的粉碎设 备有电磨机、球磨机、万能粉碎机、绞肉机、击碎机 等。
(二)物理法
1.反复冻融法
把待破碎的样品冷至－15～－20℃， 使之凝固，然后缓慢地溶解，如此反复操 作，大部分动物性的细胞及细胞内的颗粒 可以破碎。