免疫学检测法

免疫学检测法
免疫学检测技术的用途非常广泛，它们可用于有关免疫疾病的诊断、疗效评价及发病机制的研究。

如对传染病、免疫增殖性疾病、免疫缺损病、超敏反响、自身免疫病、移植排斥反响肿瘤的免疫学检测，对诊断、治疗均有很大帮助。

此外在医学生物学研究中对抗原性物质或细胞的定性、定量检查不仅推动了对各种免疫学现象的研究，而且扩大免疫学与医学生物许多领域的联系。

本章仅介绍常用免疫学检测方法的原理，简要过程和实用意义。

第一节抗原或抗体的检测
一、检测的原理
借助抗原和抗体在体外特异结合后出现的各种现象，对样品中的抗原或抗体进展定性、定量、定位的检测。

1．抗原与抗体的亲和力(affinity)抗原抗体的结合就像酶与底物的结合，激素与其受体的结合一样不是化学的反响，而是非共价键的可逆的结合。

抗原决定簇和抗体分子可变区互补构型，造成两分子间有较强的亲和力。

空间构型互补程度不同，抗原和抗体分子之间结合力强弱也不同。

互补程度高，则亲和力强。

此外，反响温度、酸碱度和离子浓度对抗原和抗体分子上各基因的解离性和电荷特性也有重要的影响，抗体与抗原决定簇之间的结合力大小可用亲合力来表示。

高亲合力的抗体与抗原的结合力强，即使抗原浓度很低时也有较多的抗体结合抗原形成免疫复合物。

2．抗原或抗体外检测原理根据抗原抗体结合形成免疫复合物的性状与活性特点，对标本中的抗原或抗体进展定性、定位或定量的检测。

定性和定位检测比拟简单，即用的抗体和待检样品混合，经过一段时间，假设有免疫复合物形成的现象发生，就说明待检样品中有相应的抗原存在。

假设无预期的现象发生，则说明样品中无相应的抗原存在。

同理也可用的抗原检测样品中是否有相应抗体。

对抗原或抗体进展定量检测时，以反响中参加抗原和抗体的浓度与形成免疫复物的浓度呈函数关系。

〔1〕根据免疫复合物产生的多少来推算样品中抗原〔或抗体〕的含量：在一定的反响条件下，参加的抗体〔或抗原〕的浓度一定，反响产生的免疫复合物多少与待检样品中含有相应抗原〔或抗体〕量成正比。

也就是抗体浓度一定时，免疫复合物越多则样品中的抗原量也越多。

可用实验性标准曲线推算出样品中抗原〔或抗体〕的含量。

如免疫单向扩散试验、免疫比浊试验和酶联免疫检测等都属于类方法。

〔2〕抗原或抗体效价滴定的原理：当抗原抗体复合物形成多少不能反响抗原抗体反响强弱时，就不能以检测反响强度来对抗原或抗体进展定量。

在实际工作中，把浓度低的反响成分〔抗原或抗体〕的浓度固定，把浓度高的另反响成分作一系列稀释。

例如用人血清作抗原免疫3只家兔，比拟3只家兔产生抗体的多少，即滴定3只兔血清抗体效价，可用双向琼脂扩散法来滴定，例如将抗体浓度固定，将抗原作不同的稀释度，分别将抗原或抗体滴入琼脂的相应小孔中，观察免疫兔血清与不同稀释度的抗原出现明显沉淀浅的抗原稀释度〔如甲兔的抗体效价为1/2000，而丙免的是1/8000则可比拟出后者比前者产生抗体
的效价要高〕。

也就是表示效价的稀释度越高，样品中所含待检成分越多。

因人血清〔抗原〕和抗体〔免疫兔血清〕相比，浓度高，故应稀释抗原。

二、抗原或抗体检测的实用意义
1．抗体检测的意义检测抗体可用于评价人和动物免疫功能的指标。

抗体用于临床治疗或实验研究时也需做纯度分析和定量测定。

临床上检测病人的抗病原生物的抗体、抗过敏原的抗体、抗HLA抗原的抗体、血型抗体及各种自身抗体，对有关疾病的诊断有重要意义。

2．抗原检测的意义可做为抗原进展检测的物质可以下四类：
〔1〕各种微生物及其大分子产物：用于传染病诊断、微生物的分类及鉴定以及对菌苗、疫苗的研究。

〔2〕生物体各种大分子物质：包括各种血清蛋白〔如各类免疫球蛋白、补体的各种成分〕、可溶性血型物质、多肽类激素、细胞因子及癌胚抗原等均可做为抗原进展检测。

在对这些成分的生物学作用的研究以及各种疾病的诊断有重要意义。

〔3〕人和动物细胞的外表分子：包括细胞外表各种分化抗原〔如CD抗原〕、同种异型抗原〔血型抗原或MHC抗原〕、病毒相关抗原和肿瘤相关性情抗原等。

检测这些抗原对各种细胞的分类、分化过程及功能研究、对各种与免疫有关的疾病的诊断及发病机制的研究，均有重要意义。

〔4〕各种半抗原物质：*些药物、激素和炎症介质等属于小分子的半抗原，可以分别将它们偶联到大分子的载体上，组成人工结合的完全抗原。

用其免疫动物，制备出各种半抗原的抗体，应用于各种半抗原物质的检测，例如对*些病人在服用药物后进展血中药物浓度的监测。

对运发动进展服用违禁药品的检测，都是应用半抗原检测的方法。

三、抗原或抗体检测的方法
由于各种检测方法中所用的抗原性状不同，出现结果的现象也不同。

最广泛应用方法有下述几种：
〔一〕沉淀反响
可溶性抗原与抗体结合，在两者比例适宜时，可形成较大的不溶性免疫复合物。

在反响体系中出现不透明的沉淀物，这种抗原抗体反响称为沉淀反响〔pre cipitation neaction〕。

1．环状沉淀试验先将含抗体的未稀释的免疫血清加到直径小于0.5c m的小试管底部。

将稀释的含有可溶性抗原的材料重叠于上，让抗原与抗体在两液体的界面相遇，形成白色免疫复合物沉淀环，故名为环状沉淀试验〔ring precipitationtest〕,此法简便易行，需用材料较多是其缺点。

2．单向免疫扩散试验单向免疫扩散试验〔single immunodiffusion〕是在凝胶中进展的沉淀反响。

将抗体混入加热溶解的琼脂中，倾注于玻片上，制成含有抗体的琼脂板，在适当位置打孔，将抗原材料参加琼脂板的小孔，让抗原
从小孔向四周的琼脂中扩散，与琼脂中的抗体相遇形成免疫复合物。

当复合物体积增加到一定程度时停顿扩散，出现以小孔为中心的圆形沉淀圈，沉淀圈的直径与参加的抗原浓度成正相关。

本方法简便，易于观察结果，可测定抗原的灵敏度〔最低浓度〕约为10～20μg/ml，常用于定量测定人或动物血清IgG、IgM、I gA和C3等，其缺点是需1～2天才能看结果〔图20-1〕
图20-1 单向免疫扩散试验示意图
3．免疫比浊法当抗体浓度高，参加少量可溶性抗原，即可形成一些肉眼看不见的小免疫复合物，它可使通过液体的光束发生散射，随着参加抗原增多，形成的免疫复合物也增多，光散射现象也相应加强。

免疫比浊法〔immunone phelomytry〕就是在一定的抗体浓度下，参加一定体积的样品，经过一段时间，用光散射浊度计〔nephelometry〕测量反响液体的浊度，来推算样品中的抗原含量。

本法敏感、快速简便，可取代单向扩散法定量测定免疫球蛋白的浓度。

4，双向免疫扩散试验双免疫扩散试验〔double immunodiffusion〕是在琼脂板上按一定距离打数小孔，在相邻的两孔分别放入抗原和抗体材料。

当抗原和抗体向四周凝胶中扩散，在两孔间可出现2～3条沉淀线，本法常用于抗原或抗体的定性或定量检测，或用于两种抗原材料的抗原相关性分析〔图20-2〕。

图20-2 双向免疫扩散试验示意图
5．对流免疫电泳对流电泳〔counterimmunoelectrophoresis〕是一敏感快速的检测方法，即在电场作用下的双向免疫扩散。

将琼脂板放入电泳槽，使
琼脂板的两孔沿着电场的方向，于负极侧的孔参加抗原，于正极侧的孔参加抗体，通电后，抗原带负电荷向正极泳动，抗体分子虽也带负电荷，但因分子量大，向正极的位移小，而受琼脂中电渗作用向负极移动，抗原和抗体能较快地集中在两孔之间的琼脂中形成免疫复合物的沉淀线。

只需1小时左右即可观察结果。

6．免疫电泳免疫电泳(immunoelectrophoresis)的方法分成两个步骤，即先进展电泳，再进展琼脂扩散。

先将样品参加琼脂中电泳，将抗原各成分依电泳速度不同而分散开。

然后在适当的位置上沿电泳方向挖一直线形槽，于槽参加含有针对各种抗原混合抗体液，让各抗原成分与相应抗体进展双向免疫扩散，可形成多答卷沉淀线。

常用此法进展血清的蛋白种类分析。

对于免疫球蛋白缺损或增多的疾病的诊断或鉴别诊断有重要意义〔图20-3〕。

图20-3 免疫电泳法根本步示决图
7．免疫印迹法免疫印迹法〔immunoblotting〕又称为Western印迹法，用于AIDS的血清抗体检测。

第一步，为电泳别离HIV抗原，在电场中根据分子量大小不同病毒抗原各成分散开。

第二步，将电泳别离的蛋白质转移到硝酸纤维膜上〔电印迹〕，然后将印迹有病毒抗原的硝酸纤维膜浸湿于病人血清中。

如果病人血清中含有与一种或几种抗原相对应的抗体的话，则在该抗原印迹部位形成免疫复合物沉淀。

在洗去未沉淀的抗原和抗体后，在膜上加标记的抗人免疫球蛋白的抗体，此抗体可以和病毒抗原与人抗体形成的免疫复合物发生反响，最后参加显色底物〔如果抗人Ig是用酶标记的〕或做放射自显影〔抗人Ig用125Ⅰ标记〕以显示结果〔图20-4〕。

图20-4 用免疫印迹法检查血清中的HIV病毒抗体
第一步：经电泳将HIV混合抗合抗原按分子量大小别离；
第二步：将已别离的抗原经电印迹转移到硝酸纤维膜上；
第三步：将待检病人血清参加覆盖于硝酸纤维膜上；
第四步：参加标记的第二抗体使之覆盖膜上；
第五步：参加显色底物〔或放射自显影〕显现第二抗体〔二〕凝集反响
细菌、红细胞或外表带有抗原的乳胶颗粒等都是不溶性的颗粒抗原，当与相应抗体结合，抗原与抗体结合形成凝集团块，即称为凝集反响〔agglutination〕。

1．直接凝集直接凝集〔direct agglutination〕是将细菌或红细胞与相应抗体结合产生的细菌凝集或红细胞凝集现象。

可用于传染病诊断如肥达氏反响〔Widal reaction〕诊断伤寒病。

或利用血细胞凝集现象检查血型。

2．间接凝集间接凝集〔indirect agglutination〕是用可溶性抗原包被在乳胶颗粒或红细胞外表，与相应抗体混合出现的凝集现象。

如用γ球蛋白包乳胶颗粒检测类风湿关节炎病人血清中的类风湿因子，用甲状腺球蛋白包被乳胶颗粒用于检测甲状腺球蛋的抗体。

也可以将抗体吸附到乳胶颗粒上检查临床标本中的抗原，如细菌或真菌性脑膜炎抗体包被的乳颗粒，一旦与含有相应抗原的脑脊
液混合，便可发生凝集，可进展快速诊断。

故凝集反响即可测定抗原，也可测抗体，方法简便、敏感。

3．抗球蛋白试验抗球蛋白试验〔antiglobulin test,coombs test〕的原理为间接凝集试验。

例如应用于诊断自身免疫溶血性贫血症时，Rh+红细胞与抗Rh血清间的反响。

因抗Rh抗体是IgG只有两个结合价，分子较小〔不如IgM 结合价多，分子大〕很难直接引起Rh+红细胞凝集。

如果参加抗IgG的抗体，就可帮助抗Rh的IgG的抗体凝集红细胞。

也就是经抗Ig的作用提高凝集反响的灵敏度。

〔三〕补体参与抗原抗体反响
这一类反响主要包括溶血反响〔hemolytic assay〕、补体介导的细胞毒试验〔plement mediated cytoto*icuty test〕及补体结合试验〔plement fi*a tion test〕。

1．溶血反响抗体与红细胞外表抗原相遇，形成红细胞-抗体复合物即可使参加反响中的补体活化，导致红细胞溶解，此方法可用于红细胞的各种抗原或相应抗体的检测，此法比凝集反响敏感。

溶血反响也是用于抗体分泌细胞即空斑形成细胞〔PFC〕检测的原理。

2．补体介导的细胞毒试验各种有核细胞与针对其外表抗原的抗体相遇，所形成的免疫复合物能活化反响中的补体，引起细胞膜穿孔，在一定时间，细胞仍能维持一定的形态不破碎，参加水溶性染如伊红Y〔eosin Y〕或台盼蓝〔tryp an blue〕后，染料即可进入被活化补体穿孔的细胞，不带相应抗原细胞膜保持
完整的活细胞不着色。

此方法可用于带各种抗原的细胞的检测，如进展细胞MH C抗原的鉴定，和进展淋巴细胞中T细胞总数或其亚类的计数。

在一些免疫学实验中也可用这种方法，根据需要特异地消除带*种抗原的细胞。

3．补体结合试验当抗原〔可溶性或颗粒性〕与相应抗体结合，由于浓度低不出现可见反响时，应用补体结合试验可检出此抗原抗体反响，它比凝集反响或沉淀反响灵敏度高。

本法包括两个抗原抗体系统。

一为检测系统由待检样品与抗原〔或抗体〕组成；另一为指示系统，由绵羊红细胞〔SRBC〕和抗SRBC组成。

另参加作为补体的新鲜豚鼠血清。

试验时试管中先参加检测系统和补体，混合经37℃30分钟使抗原、抗体、补体形成复合物，再参加指示系统，如出现溶血现象，说明检测系统中没有相对应的抗原抗体，补体是游离的指示系统的SR BC和抗体结合而出现溶血，即为反响阴性。

如不出现溶血，说明检测系统中有抗原抗体复合物并结合补体，则指示系统无多余的补体作用而没有溶血现象，即为阳性。

在敏感的抗原、抗体检测方法〔如酶标方法〕出现之前补体结合试验曾广泛用于检测各种细菌、病毒或螺旋体〔如梅毒〕的抗原或抗体，由于本试验影响因素多，结果不稳定现已被新检测方法所代替。

四、用标记抗体或抗原进展的抗原、抗体反响
用荧光素、同位素或酶标记抗体或抗原，用于抗原或抗体检测是广泛应用的敏感、可靠的方法。

上述三种常用的标记物与抗原或抗体化学连接之后不改变后者的免疫特性。

本方法可用于定性、定量或定位检测。

1．免疫荧光技术免疫荧光技术〔immunofluorescence techni〕是用化学方法使荧光素标记的抗体〔或抗原〕与组织或细胞中的相应抗原〔或抗体〕结合，进展定性定位检查抗原或抗体的方法。

〔1〕直接荧光法：把荧光抗体加到待检的细胞悬液，细胞涂片或组织切片上进展染色，经抗原抗体反响后，洗去未结合的荧光抗体，将待检标本在荧光显微镜下观察，有荧光的部位即有相应抗原存在，此法可用于病毒感染细胞、带*种特异抗原的细胞〔如T细胞和B细胞〕或病原菌的检查，也可用于组织中沉着的免疫复合物的检查。

本法的缺点是检查多种抗原，就需分别制备相应的多种标记抗体。

〔2〕间接荧光法：可克制直接法需制备多种荧光抗体的复杂操作。

将组织或细胞上的抗原直接与相应抗体〔不标记荧光〕结合，此为第一抗体，再把能与第一抗体特异结合的荧光标记的抗免疫球蛋白抗体参加，此为荧光标记的第二抗体，观察结果与直接法一样。

间接法比直接法敏感性高，如果用于检查抗原的第一抗体是人或动物的只需制备一种抗人或动物的免疫球蛋白荧光抗体〔图20-5〕。

图20-5 免疫荧光直接法及间接法原理示意图
免疫荧光技术在传染病诊断上有广泛的用途，如在细菌、病毒、螺旋体感染的疾病，检查抗原或抗体，如查出IgM抗体，可做为近期接触抗原的标志，所以使用荧光标记抗IgM可诊断近期感染。

除微生物学方面的应用外，还可利用单克隆抗体鉴定淋巴细胞的亚类。

使用流式细胞仪(fluorescene-activated cel
l sorting,FACS)，能自动检测细胞的大小、荧光强度。

针对细胞外表不同抗原，可以使用两种不同的荧光染料，如用异硫氰荧光素〔FITC〕发黄绿荧光，用罗丹明〔TMRITC〕发红色荧光。

由于荧光颜色不同标记两种不同的抗体，对同一细胞进展双标记染色。

对淋巴细胞亚类鉴定起着巨大推动作用。

应用间接荧光法也用于自身免疫病的抗核抗体检查。

2．放射免疫分析法放射免疫分析法〔radioimmunoassay RIA〕应用竞争性结合的原理，应作放射性同素标记抗原〔或抗体〕与相应抗体〔或抗原〕结合，通过测定抗原抗体结合物的放射活性判断结果，本方法可进展超微量分析，敏感性高，可用于测定抗原、抗体、抗原抗体复合物。

本法常用的同位素有12 5Ⅰ和131Ⅰ。

放射免疫分析常用的有液相法和固相法两种：
〔1〕液相法：将待检标本〔例如含胰岛素抗原〕与定时的同位素标记的胰岛素〔抗原〕和定时的抗胰岛素抗体混合，经一定作用时间后，别离收集抗原抗体复合物及游离的抗原，测定这两局部的放射活性，计算结合率。

在反响系统中，待检标本的胰岛素抗原与同位素标记的胰岛素竞争夺战性与胰岛素抗体结合。

非标记的抗原越多，标记抗原与抗体形成的复合物越少。

非标记抗原含量与标记抗原抗体复合物的量呈一定的函数关系。

预先用标准的非标记抗原作成标准曲线后，即可查出待检标本中胰岛素的含量〔图20-6〕。

图20-6 液相放射免疫分析法原理及标准曲线
〔2〕固相法：将抗原或抗体吸附到固相载体外表，然后加待检标本，最后加标记抗体。

测定固相载体的放射活性，常用的固相载体有溴化氰〔Br〕海豹化的纸片或聚苯乙烯小管〔图20-7〕。

图20-7 固相放射免疫分析法原理
放射免疫分析法应用围广泛，包括多种激素〔胰岛素、生长激素、甲状腺素等〕维生素、药物、IgE等。

3．酶联免疫分析法酶联免疫分析法〔enzyme immunoassay,EIA〕是当前应用最广泛的免疫检测方法。

本法将抗原抗体反响的特异性与酶对底物高效催化作用结合起来，根据酶作用底物后显色，以颜色变化判断试验结果，可经酶标测定仪作定量分析，敏感度可达ng水平。

常用于标记的酶有辣根过氧化物酶(horseradish pero*idase)、碱性磷酶〔alkaline phosphatase〕等。

它们与抗体结合不影响抗体活性。

这些酶具有一定的稳定性，制成酶标抗体可保存较长时间。

目前常用的方法有酶标免疫组化法和酶联免疫吸附法。

前者测定细胞外表抗原或组织的抗原；后者主要测定可溶性抗原或抗体。

本法既没有放射性污染又不需昂贵的测试仪器，所以较放射免疫分析法易推广。

图20-8 生物素－酶标亲合素系统反响示意图
〔1〕酶联免疫吸附试验〔enzyme linked immunosorbent assay,ELI SA〕:是与上述固相RIA相似的原理，将抗原或抗体吸附在固相载体外表。

使抗原抗体反响在固相载体外表进展政区。

可用间接法、双抗体夹心法或竞争法测定抗原或抗体。