制剂微生物限度检测操作规程

制剂微生物限度检测操作规程
微生物限度检查法系指非规定灭菌制剂及其原、辅料受到微生物污染程度的一种检查方法，包括染菌量及控制菌的检查。

供试品应随机抽样。

一般抽样量为检验用量（2个以上最小包装单位）的3倍量。

检查的全过程，均应严格遵守无菌操作，严防再污染。

除另有规定外，本检查法中细菌培养温度为30 ~35℃，霉菌、酵母菌培养温度为25 -28℃，控制菌培养温度为36C +1℃。

检验结果的报告以1 9、1ml或lOcm2为单位。

1．细菌、霉菌与酵母菌计数
(1)平皿菌落计数法取均匀供试液，进一步稀释成1：102、1：103等适宜的稀释级。

分别取连续三级10倍稀释的供试液各Iml，置直径约90mm平皿中，再注入约45℃的培养基约15ml，混匀．待凝固后，倒置培养，每稀释级应作2-3个平皿。

营养琼脂培养基用于细菌计数，玫瑰红钠琼脂培养基用于霉菌计数。

在特殊情况下，前者同时点计霉菌、酵母菌菌落数，后者同时点计细菌菌落数。

酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基用于酵母菌计数。

合剂用玫瑰红钠琼脂培养基与酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基分别测定霉菌、酵母菌菌落数，合并计数。

液体制剂用玫瑰红钠琼脂培养基同时点计霉菌菌落及酵母菌菌落数。

菌数测定阴性对照试验：取供试验用的稀释剂各Iml，置4个无菌平皿中，分别按细菌、霉菌计数用的培养基制备平板，培养，检查，不得长菌。

细菌培养时间为48小时，分别在24小时及48小时点计菌落数，一般以48小时菌落数为准，霉菌、酵母菌培养时间为72小时，分别在48小时及72小时点计菌落数，一般以72小时为准，菌落如蔓延生长成片，不宜计数。

点计后，计算各稀释级的平均菌落数，按菌数报告规则报告菌数。

菌数报告规则：细菌宜选取平均菌落数在30 ~300之间的稀释级，霉菌宜选取平均菌落数30 -100之间的稀释级作为报告菌数计算的依据。

如有1个稀释级在30~30~0（30 ~100）之间时，将该稀释级的菌落数乘以稀释倍数报告；如同时有2个稿释级在30~300 (30~100)之间时，按下式计算两级比值。

比值=（高稀释级的平均菌落数×稀释倍数）÷（低稀释级的平均菌落数×稀释倍数）当比值≤2时，以两稀释级的均值报告，当比值>2时，以低稀释级的平均菌落数乘以稀释倍数报告；如同时有3个稀释级的平均菌落数均在30 -300之间时，以后2个稀释级计算级间比值报告；如各稀释级的平均菌落数均不在30 -300之间，以最接近30或300的稀释级平均菌落数乘以稀释倍数报告；如各稀释级平均菌落数均在300 (100)以上，按最高稀释级平均菌落数乘以稀释倍数报告；如各稀释级平均菌落数均小于30时，一般按最低稀释级平均菌落数乘以稀释倍数报告。

如当1：10（或1：100）的稀释级平均菌落数等于或大于原液（或1：10）稀释级时，应以培养基稀释法测定，按测定结果报告菌数。

(2)培养基稀释法取供试液（原液或1：10、1：100供试液）3份，每份各1ml，分别注入5个平皿内（每皿0. 2ml）。

每1个平皿倾注营养琼脂培养基约15ml，混匀，凝固后，倒置培养，计数。

每Iml注入的5个平板的菌落数之和，即为每1ml的菌落数，共得3组数据。

以3份供试液菌落数的平均值乘以稀释倍数报告。

如各稀释级平板均无菌落生长，或仅最低稀释级平均菌落数小于1时，则报告菌数为小于10个。

2．控制菌检查除另有规定外，取供试液10 ml（相当于供试品1 9、Iml、10cm2），直接或处理后接种，经增菌、分离培养后，进行革兰染色、生化试验与血清凝集试验等项检查，
(1)大肠埃希菌（Escherichia coli）取胆盐乳糖培养基3份，每份lOOni[，2份分别加入规定量的供试液，其中1份加入对照菌50 -100个作阳性对照，第3份加入与供试液等量的稀释液作阴性对照。

培养18 - 24小时（必要时可延至48小时）。

阴性对照应无菌生长。

取上述3份的培养物各0.2ml，分别接种至5ml MUG培养基管内培养，分别于5小时与24小时时，取未接种的MUG培养基管作本底对照，将各管置365nm紫外光下观察。

阳性对照管呈现荧光，MUG阳性。

供试液的MUG管呈现荧光，MUG阳性；无荧光，MUG阴性。

然后加数滴靛基质试液于MUC管内，液面呈玫瑰红色为阳性，呈试剂本色为阴性。

当阴性对照呈阴性，阳性对照正常生长，供试液胆盐乳糖培养基培养液澄明，并证明无菌生长，判未检出大肠埃希菌。

供试液MUG阳性，靛基质阳性，判检出大肠埃希菌；MUG 阴性，靛基质阴性，判未检出大肠埃希菌。

如MUG阳性、靛基质阴性，或MUG阴性、靛基质阳性，均应取供试液胆盐乳糖培养基培养物划线于曙红亚甲蓝琼脂平板或麦康凯琼脂平板，培养18 - 24小时，如上述供试液培养物的分离平板无菌落生长，判未检出大肠埃希菌。

攻有菌落生长，应挑选2-3个可疑菌落作靛基质试验(I)、甲基红试验(M)、乙酰甲基甲醇生成试验(V -P)、枸橼酸盐利用试验(C)及革兰染色、镜检，按表1规定判断结果。

表1 MUG的结果判断
IMVic试验③革兰阴性杆菌
靛基质试验(I)取可疑菌落或斜面培养物，接种于蛋白胨水培养基中，培养24小时，沿管壁加入靛基质试液数滴，液面呈玫瑰红色为阳性，呈试剂本色为阴性。

甲基红试验(M)取可疑菌落或斜面培养物，接种于磷酸盐葡萄糖胨水培养基中，培养(48±2)小时，于管内加入甲基红指示剂数滴，立即观察，呈鲜红色或橘红色为阳性，呈黄色为阴性。

乙酰甲基甲醇生成试验(V-P)取可疑菌落或斜面培养物，接种于磷酸盐葡萄糖胨水培养基中，培养(48±2)小时，于每2ml培养液中加入a-萘酚乙醇试液1ml，混匀，再加40%氢氧化钾溶液0.4ml，充分振摇，在4小时内出现红色为阳性，无红色反应为阴性。

枸橼酸盐利用试验(C)取可疑菌落或斜面培养物，接种于枸橼酸盐培养基的斜面上，一般培养48 -72小时，培养基斜面有菌落生长，培养基由绿色变为蓝色时为阳性，培养基颜色无改变为阴性。

(2)沙门菌（SaLmnonella apecies）取营养肉汤培养基3份，每份100ml，2份分别加入规定量的供试液，其中1份加入对照菌液作为阳性对照，第3份加入与供试液等量的稀释液作阴性对照。

培养18 ~24小时，阴性对照应无菌生长。

取其余2份培养物各Iml，分别接种于四硫磺酸钠亮绿培养基lOml中．培养18 - 24小时。

分别划线接种于胆盐硫乳琼脂（或
沙门、志贺菌属琼脂）培养基和麦康凯琼脂（或曙红亚甲蓝琼脂）培养基的平板上，培养18—24小时或延至40 - 48小时。

当阳性对照的平板呈现阳性菌落时，供试品的平板无菌落生长，或有菌落但不同于沙门菌菌落形态特征（表2）时，可判为未检出沙门菌。

表2沙门茵菌落形态特征
如供试品平板生长的菌落特征有沙门菌菌落形态特征相符或疑似者，均应挑选2-3个菌落分别接种于三糖铁琼脂培养基斜面上，阳性对照同时接种该培养基，培养18—24小时后，阳性对照的斜面应为红色，底层为黄色，硫化氢阳性，而供试品的疑似菌未见红色、底层未见黄色，可判为未检出沙门菌。

否则，应继续做以下试验。

靛基质试验照大肠埃希菌项下操作并判断结果。

脲酶试验(M)取疑似菌斜面培养物接种于脲琼脂培养基斜面，培养24小时，斜面变为红色为阳性，木变色为阴性。

氰化钾试验取培养20 - 24小时的疑似菌株营养肉汤培养液，分别用白金耳沾取1环，接种至对照培养基及氰化钾培养基，立即以橡胶塞塞紧，培养24 -48小时，对照管应有菌生长，试验管有菌生长者为阳性，无菌生长者为阴性。

赖氨酸脱羧酶试验取疑似菌斜面培养物分别接种于赖氨酸脱羧酶培养基及对照培养基，培养24 -48小时，对照管应为黄色，试验管呈紫色为阳性，呈黄色为阴性。

动力检查取疑似菌斜面培养物穿刺接种于半固体营养琼脂培养基中，培养24小时，细菌沿穿刺外周扩散生长，为动力阳性，否则为阴性。

阴性培养物，应在室温保留2-3天后，再判断。

血清凝集试验在洁净载玻片一端，以白金耳沾取沙门菌属A-F“O”多价血清2—3环，再取斜面上部的培养物少许，与血清混合，将玻片前后侧动，如出现凝集现象，应以0.9%氯化钠溶液与同株培养物作对照试验，无凝集现象时判为血清凝集阳性。

时有反应迟缓，需将玻片与湿棉球置平皿内，约过20分钟，再观察。

仍未出现凝集时，应取斜面培养物，置含少量0.9%氯化钠溶液的试管中，制成浓菌悬液，在100℃水浴中保温30分钟，待冷，再作凝集试验。

如出现凝集，应判为阳性，否则为阴性。

上述各项试验反应，一般应为硫化氢阳性（或阴性），靛基质阴性，脲酶阴性，氰化钾阴性，赖氨酸脱羧酶阳性，动力阳性，A-F“O”多价血清凝集试验阳性。

各鉴定结果按表3判定。

表3沙门菌检查结果判定
上述各项试验任何一项不符合或有可疑反应的培养物，圬应进一步鉴定后作结论。

(3)铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruguzosa）取胆盐乳糖培养基3份，每份100ml，2份分别加入规定量的供试液，其中1份加入对照菌液作为阳性对照，第3份加入与供试液等量的稀释液作阴性对照。

培养18 - 24小时，阴性对照应无菌生长，其余2份培养液划线接种于溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基平板上，培养18 - 24小时。

当阳性对照的平板呈现阳性菌落时，供试品的平板无菌落或无疑似菌落生长，可判未检出铜绿假单胞菌。

铜绿假单胞菌典型菌落呈扁平、无定形、周边扩散、表面湿润，灰白色，周围时有蓝绿色素扩散。

如生长菌落具有上述特征或疑似者，应挑选2—3个菌落，分别接种于营养琼脂培养基表面上，培养18 ~24小时，取培养物革兰染色，并做氧化酶试验。

氧化酶试验取洁净滤纸片置于平皿内，用无菌玻璃棒取营养琼脂培养基斜面培养物涂于滤纸片上，再滴加新配制的1%二盐酸二甲基对苯二胺试液，在30秒内呈粉红色逐渐变为紫红色为氧化酶试验阳性，否则为阴性。

如证实为非革兰阴性无芽孢杆菌或氧化酶试验阴性，均可判为未检出铜绿假单胞菌。

否则，应进行绿脓菌素试验。

绿脓菌素( Pyocyanin)试验取上述琼腊培养物，接种于绿脓菌素测定用培养基斜面上，培养24小时后，在试管内加三氯甲烷3 ~5ml，搅碎培养基并充分振摇。

静置片刻，将三氯甲烷移至另一试管中，加入Imol/L盐酸试液约Iml，振摇后，静置片刻，如在盐酸溶液层内出现粉红色，即为绿脓菌素阳性。

试验同时应作阴性对照。

当阴性对照试验呈阴性时，并为革兰阴性杆菌、氧化酶试验阳性，可判检出铜绿假单胞菌。

铜绿菌素阴性的培养物，应继续做以下试验。

硝酸盐还原产气试验取营养琼脂培养基斜面培养物，接种于硝酸盐胨水培养基中，培养24小时后，如在培养基的杜氏管中有气体产生，即为阳性。

42℃生长试验取营养琼脂培养基斜面培养物于0.9%无菌氯化钠溶液中，制成菌悬液，再将菌悬液接种于营养琼脂培养基斜面上，立即置41℃±1℃水浴中培养24 -48小时，有菌苔生长者为阳性，否则为阴性。

明胶液化试验以接种针沾取营养琼脂培养基斜面培养物，穿刺于明胶培养基内，培养24小时，取出置冰箱内10 -30分钟。

如培养基仍呈溶液状，为阳性。

当为革兰阴性杆菌、氧化酶试验阳性、绿脓菌素试验阴性，其硝酸盐还原产气试验、42℃生长试验及明胶液化试验均为阳性时，应判检出铜绿假单胞菌。

(4)金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）取亚碲酸钠肉汤（或营养肉汤）培养基3份，每份100ml，2份分别加入规定量的供试液，其中1份加入对照菌液作为阳性对照，第
3份加入与供试液等量的稀释液作阴性对照。

培养18 - 24小时（必要时可延至48小时）。

阴性对照应无菌生长。

取其余2份培养液划线接种于卵黄高盐琼脂培养基平板或甘露醇高盐琼脂培养基平板上，培养24 -72小时。

当阳性财照的平板呈现阳性菌落时，供试品的平板如无菌落生长，或有菌落但不同于表4所列特征，可判未检出金黄色葡萄球菌。

表4金黄色葡萄球菌茵落形态特征
如有菌落生长并具有金黄色葡萄球菌菌落形态特征或疑似者，应挑选2-3个菌落，分别接种于营养琼脂培养基表面上，培养18—24小时，取培养物革兰染色，并做血浆凝固酶试验。

血浆凝固酶试验取灭菌小试管3支，各加入血浆一无菌水(1:1)0.5ml，1支加入被检菌株的营养肉汤培养液（或浓菌悬液）0. 5ml，1支加入金黄色葡萄球菌的营养肉汤培养液或菌悬液0. 5ml作阳性对照，另1支加入营养肉汤或0.9%无菌氯化钠溶液0.5ml作阴性对照。

将3管同时培养。

3小时后开始检查，以后适当时间逐次观察直至24小时。

阴性对照管的血浆流动自如，阳性对照管血浆凝固，试验管血浆凝固者为阳性；阳性对照管和阴性对照管任何一管不符合要求时，应另制备血浆，重新试验。

当阴性对照和阳性对照符合要求，供试品的菌株为革兰阳性球菌、血浆凝固酶试验阳性时，判定为检出金黄色葡萄球菌。