蛋白质SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳简易教程

蛋白质SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳简易教程
一、相关仪器和试剂的准备：
（一）仪器：
1、垂直电泳仪（本体、干净玻璃板、制胶架、梳子等）。

2、移液器：1000μL、100μL、10μL各一支及枪头若干。

3、一只干净小烧杯和加热大烧杯。

4、可提供500V电压的电源。

5、用于染色和脱色的容器。

6、用于加热的电炉子
7、手套一副
8、微量进样器
（二）试剂：
1、二次蒸馏水。

2、30%丙烯酰胺混合溶液。

3、1.5mol/L的Tris（pH=8.8）和0.5mol/L的Tris（pH=6.8）。

4、10%的SDS（十二烷基硫酸钠）溶液和10%的过硫酸铵溶液。

5、TEMED（四甲基乙二胺）标准品。

6、染色液、脱色液和电极缓冲液
7、蛋白Marker系列（Marker、Loading buffer，）
二、样品制备
各取样品40μL于小离心管，加入10μL样品缓冲溶液，混匀。

沸水中加热5min，待用。

Marker取40μL，一起加热（可以用4次）
三、各溶液的配制
1、30%丙烯酰胺混合溶液。

29g丙烯酰胺，与1g甲叉双丙烯酰胺混合，定容到100mL，过滤。

2、10% SDS溶液
取5g SDS，用水溶解后，注入50mL容量瓶中，定容。

（SDS为有机溶剂，在配制时易起泡沫，定容时应在泡沫全部退去后再定容，以免不准确）
3、10%过硫酸铵溶液
取5g过硫酸铵，用水溶解后，注入50mL容量瓶中，定容。

4、分离胶缓冲溶液
1.5mol/L pH=8.8的Tris-HCl缓冲溶液：将18.15g Tris用98mL水溶解后，用浓盐酸调至pH为8.8，定容到100mL
5、浓缩胶缓冲溶液
0.5mol/L pH=6.8的Tris-HCl缓冲溶液：将6.0g Tris用98mL水溶解后，用浓盐酸调至pH为6.8，定容到100mL
6、分离胶（12%）和积层胶（5%）的配制
7、电极缓冲液
将6g Tris，28.8g甘氨酸和1g SDS加水溶解后，定容到1000mL，pH应为8.3。

8、考马斯亮蓝染色法溶液配制
（1）染色液：称取0.25g考马斯亮蓝（G250），加入45mL甲醇、10mL冰醋酸和45mL 水，过滤后使用。

（2）脱色液（新制）：37.5mL冰醋酸、25mL甲醇加水到500mL。

9、银染法溶液配制
（1）固定液：250 mL甲醇，25 mL冰醋酸，225 mL水。

（2）敏化液：0.02%的Na2S2O3 .5H2O溶液。

（3）显影液：0.04%甲醛溶在2%Na2CO3中。

四、垂直电泳装置的组装及胶的灌制。

1、松开本体上的螺栓，拉开左右滑块，放入两块玻璃板组成凝胶室，低板的一块板向内（注：做一块板也要加上另一块板）。

合上滑块，拧螺栓锁死凝胶室。

2、将上述组合放入制胶架，插入并旋转凸轮固定。

3、灌入分离胶，至距离上沿3cm处。

加入约1mm厚的一层水，放置至胶凝，约40min 左右。

（胶要现灌现配，以免聚合）
4、分离胶凝固后，用滤纸吸干上层的水，配制积层胶，灌至上沿，插上木梳，放置约2h，凝固。

五、加样品进行电泳
1、积层胶聚合完成后，小心拔下梳子，以去离子水洗涤
加样槽，除去未聚合的聚丙烯酰胺。

松开凸轮，取出本体组合放入下槽，加入Tris-甘氨酸电极缓冲液，充满上下槽。

2、加样。

用微量注射器按预定顺序加样，每个样品的上样10μL，每加完一个样品要在去离子水中洗涤注射器。

3、将电泳装置安装上盖与电源连接（正极应接下槽），开始电泳。

在积层凝胶上加80-100V 电压，待染料前沿进入分离胶后将电压提高到180-200V继续电泳，至溴酚蓝染料前沿到达分离胶的底部，关闭电源。

（约2.5h）。

六、染色
（一）考马斯亮蓝染色
1、电泳结束后，取出凝胶室，用多用取胶器撬开玻板取出凝胶，放入容器中，加入染色液，染色1h。

2、将染色液倒入回收瓶中，以备下次使用，将脱色液倒入，浸泡脱色。

一定时期（约2h）最好更换脱色液一次，直至条带清晰。

（约2天）
（二）硝酸银染色
蛋白质条带的银染是基于蛋白质中的各种基团与银离子结合，再利用甲醛使蛋白质带上的银离子在碱性环境下被还原成金属银，沉淀在蛋白质表面而显色。

与考马斯亮蓝染色法相比较，银染的灵敏度高、操作简便、染色显色所需时间短，步骤如下：
1、固定：电泳结束后，取出凝胶室，用多用取胶器撬开玻板取出凝胶，将凝胶浸泡在固定液中20-30 min。

2、清洗：用去离子水先冲洗凝胶两次，每次1 min，然后用大量去离子水反复漂洗凝胶30 min。

3、敏化：将凝胶浸泡在敏化液中，1-2 min。

4、清洗：去离子水洗涤凝胶两次，每次10 s。

5、染色：以0.1%的AgNO3溶液浸泡凝胶，轻摇30 min。

6、清洗：去离子水漂洗30 min。

7、显影：在显影液中震荡直至出现蛋白质的清晰条带。

8、终止：以1%的冰醋酸溶液终止反应。