不同萃取法测定鸡蛋中甲氧苄啶残留量的方法比对

不同萃取法测定鸡蛋中甲氧苄啶残留量的方法比对
作者：***
来源：《食品安全导刊·下》2023年第11期
摘要：本研究在样品经乙腈提取后分别采用阳离子交换固相萃取柱萃取、乙腈饱和正己烷液液萃取和QuEChERS萃取3种不同的萃取净化方法对鸡蛋进行前处理，采用超高效液相色谱-串联质谱（Ultra Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry，UPLC-MS/MS）对鸡蛋中甲氧苄啶残留量进行测定。

研究表明3种不同萃取净化方法在0.5～50.0
μg·L-1甲氧苄啶均具有良好的线性关系，相关系数（R2）大于0.999，检出限为0.5 μg·kg-1，定量限为1.0 μg·kg-1，方法回收率均在60.3%～99.7%，相对标准偏差小于15%。

3种前处理方法均适用于鸡蛋中甲氧苄啶的测定。

关键词：甲氧苄啶；鸡蛋；固相萃取法；液液萃取法；QuEChERS萃取法；超高效液相色谱-串联质谱
Comparativer Study of the Effects of Different Extraction Methods on the Detection of Trimethoprim Residue in Egg
ZHENG Luhong1，2，3
（1.Guangdong Food Industry Institute Co.， Ltd.， Guangzhou 511442， China;
2.Guangdong Provincial Public Laboratory of Food Industry， Guangzhou 511442， China;
3.Guangdong Food Quality Supervision and Inspection Station， Guangzhou 511442， China）
Abstract： This study investigated the pre-treatment of eggs using three different extraction and purification methods， namely cation exchange solid-phase extraction， acetonitrile saturated n-hexane liquid-liquid extraction， and QuEChERS extraction， after being extracted with acetonitrile. The residues of trimethoprim in eggs were determined by ultra-high performance liquid chromatogeny-tandem mass spectrometry （UPLC-MS/MS）. The result showned that three different extraction and purification methods exhibit a good linear relationship for trimethoprim in the concentration range of 0.5 ～50.0 μg·L-1， the correlation coefficients （R2） were greater than 0.999， the
detection limit was 0.5 μg·kg-1，the quantification limit of 1.0 μg·kg-1， and the recovery rates of the methods ranged from 60.3% to 99.7% with the RSD less than 15%. These three methods are all suitable for the determination of trimethoprim in eggs．
Keywords： trimethoprim; eggs; solid phase extraction; liquid-liquid extraction; QuEChERS extraction; ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry
甲氧芐啶（Trimethoprim）是一种抗菌增效剂，常将其与磺胺类药物一起使用，使其抗菌谱扩大、抗菌活性增强，达到抗菌增效的效果[1-3]。

甲氧苄啶可用于治疗细菌感染性疾病，在兽医临床上应用十分广泛[4]。

如果养殖户违规加大甲氧苄啶用量，且不遵守停药时间，则容易导致上市畜禽产品中存在药物残留。

动物产品的甲氧苄啶残留一般不会对人体产生急性毒性作用，但长期大量摄入甲氧苄啶残留的食品，可能在人体内蓄积，导致胃肠道损害、皮肤过敏症状等。

目前，我国已批准甲氧苄啶作为增效剂与磺胺类药物联合使用。

我国农业农村部2022年颁布的《食品安全国家标准食品中41种兽药最大残留限量》（GB 31650.1—2022）规定甲氧苄啶在家禽蛋中的最大残留限量值为10 μg·kg-1[5]。

目前，针对鸡蛋中甲氧苄啶残留量分析的检测方法报道较少。

我国已有相关标准来检测动物源性食品中甲氧苄啶的含量，如《进出口动物源性食品中二甲氧苄氨嘧啶、三甲氧苄氨嘧啶和二甲氧甲基苄氨嘧啶残留的检测方法液相色谱-质谱/质谱法》（SN/T 2538—2010）[6]适用于肌肉、内脏、牛脂肪、鸡蛋、鱼肉及蜂产品中甲氧苄啶残留量的测定，但该标准未写明鸡蛋应按哪种前处理方式进行实验；《动物源性食品中磺胺类药物残留量的测定液相色谱-质谱/质谱法》（GB/T 21316—2007）[7]用于测定动物源食品（肝脏、肾脏、肌肉、水产品和牛奶）中甲氧苄啶的残留量，针对鸡蛋中甲氧苄啶残留量的检测方法相对较少。

因此，本文对比不同的萃取方法包括固相萃取法、液液萃取法和QuEChERS法的检出限、回收率、精密度以及基质效应，建立了液相色谱-串联质谱法检测鸡蛋中甲氧苄啶残留的方法，为监测鸡蛋中的甲氧苄啶残留提供技术支持。

1 材料与方法
1.1 材料與仪器
甲氧苄啶（738-70-5），BePure公司；氨水、乙腈、甲醇、正己烷、甲酸，上海安谱科技股份有限公司；氯化钠、无水硫酸钠，广州化学试剂厂；固相萃取小柱PCX（60 mg，3 mL），天津博纳艾杰尔科技有限公司；ProElut QuEChERS（15 mL）净化管，迪马公司。

超高效液相色谱-串联质谱仪，Waters公司；天平，梅特勒-托利多有限公司；离心机，天美中国科学仪器有限公司；涡旋振荡器，广州绿百草生物科技有限公司；氮吹仪，睿科仪器有限公司。

1.2 实验方法
1.2.1 试料的制备
取500 g鸡蛋，搅拌均匀后装入洁净容器内，密封并做好标识。

1.2.2 固相萃取法
称取2.0 g试样于50 mL离心管中，加入20 mL乙腈，涡旋振荡3 min，超声20 min，10 000 r·min-1离心5 min，转移上清液待净化。

PCX固相萃取小柱用3 mL水和3 mL甲醇活化后，取备用液过小柱。

依次用3 mL水和3 mL甲醇淋洗，用3 mL 5%氨水-甲醇溶液洗脱，收集洗脱液，35 ℃水浴中浓缩至近干。

用1 mL 50%乙腈水溶液溶解残渣，混匀过0.22 μm有机滤膜过滤后供UPLC-MS/MS测定。

1.2.3 液液萃取法
称取2.0 g试样于50 mL离心管中，加入20 mL乙腈，涡旋振荡3 min，超声20 min，10 000 r·min-1离心5 min，将上清液转移至另一离心管中，加入
20 mL乙腈饱和正己烷涡旋振摇5 min，10 000 r·min-1离心5 min，取乙腈层于35 ℃水浴中浓缩至近干。

用1 mL 50%乙腈水溶液溶解残渣，混匀过0.22 μm有机滤膜过滤后供UPLC-MS/MS测定。

1.2.4 QuEChERS萃取法
称取2.0 g试样于50 mL离心管中，加入20 mL乙腈，涡旋振荡2 min，超声20 min，加入3 g氯化钠和3 g无水硫酸钠，涡旋振荡2 min，10 000 r·min-1离心5 min。

转移上清液于QuEChERS净化管中，涡旋混合1 min，10 000 r·min-1离心3 min，准确吸取
5 mL已净化的提取液于35 ℃水浴中浓缩至近干。

用1 mL 50%乙腈水溶液溶解残渣，混匀过0.22 μm有机滤膜过滤后供UPLC-MS/MS测定。

1.2.5 色谱条件
色谱柱：C18柱（100 mm×2.1 mm，2.6 μm）；流速：0.4 mL·min-1；柱温：40 ℃；进样量：2 μL；流动相：A为0.1%甲酸水溶液，B为甲醇。

梯度洗脱程序：0.00～0.50 min，
95%A；0.51～3.00 min，95%A→5%A；3.01～4.00 min，5%A；4.01～
6.00 min，95%A。

1.2.6 质谱条件
通过电喷雾离子源正离子模式下进行多反应监测，电离电压1.2 kV，源温度150 ℃，雾化气温度400 ℃，锥孔气流速50 L·h-1，雾化气流速
1 000 L·h-1。

1.2.7 标准曲线的配制与基质效应
按1.2.2、1.2.3、1.2.4 3种前处理方法，分别用空白基质溶液与50%乙腈水溶液配制成0.500 μg·mL-1、1.000 μg·mL-1、2.000 μg·mL-1、
5.000 μg·mL-1、10.000 μg·mL-1、20.000 μg·mL-1和50.000 μg·mL-1的基质匹配标准工作溶液和溶剂标准工作溶液。

在相同条件下进行测定，分别建立基质标准工作曲线和溶剂标准工作曲线，通过计算基质效应（Matrix Effect，ME）值，判断基质效应。

公式为ME=（基质匹配标准工作曲线的斜率/无基质标准工作曲线的斜率-1）×100%。

|ME|值大于50%，为强基质效应；|ME|值在20%～50%，为中等基质效应；|ME|值小于20%，为弱基质效应[8]。

1.3 结果处理
实验结果采用MassLynx V4.2软件进行绘图和数据处理。

2 结果与分析
2.1 液相色谱条件的选择
甲氧苄啶呈弱碱性，正离子扫描模式下，在流动相中加入甲酸可提高待测目标化合物的电离效率和改善峰形。

因此本试验考察了0.1%甲酸水溶液-甲醇、0.1%甲酸水溶液-乙腈、水-甲醇和水-乙腈对甲氧苄啶的分离效果、灵敏度及峰形的影响。

结果表明，水相中加入0.1%甲酸可较好地提高检测响应，峰形尖锐对称，保留时间稳定，重复性好。

甲醇极性较乙腈强，在反相液相色谱中甲醇保留强于乙腈，且响应比乙腈高。

因此本文选用含0.1%甲酸水溶液-甲醇溶液作为流动相。

甲氧苄啶的总离子流图如图1。

图1 甲氧苄啶标准溶液的总离子流图
2.2 质谱条件的选择
基于目标物的分子结构和物理化学性质，选择ESI+离子化模式，通过流动注射进样对母离子和子离子进行扫描，优化目标物的锥孔电压与碰撞能量参数，获得母离子、定量离子和定性离子最优质谱参数见表1。

2.3 萃取净化方法的选择
鸡蛋中含有大量的蛋白质和脂肪，特别是磷脂，存在杂质多、基质干扰严重等问题，去除干扰因素是兽药残留检测分析的难题。

本实验对比了阳离子交换固相萃取柱萃取、乙腈饱和正己烷液液萃取和QuEChERS萃取3种不同萃取净化方法。

QuEChERS萃取净化的色谱图有较多杂峰，容易产生干扰，基质效应较大，回收率偏低。

液液萃取法能得到较为满意的除杂效果和回收率，但需要使用大量溶剂，并需要浓缩，费时。

固相萃取法能有效地将干扰组分与目标物分离，减小杂质干扰，回收率高，重现性好，且不需要使用大量有机溶剂，对环境的污染小。

3种不同萃取净化方法的图谱见图2。

相比较，固相萃取法更有优势。

1 材料与方法
1.1 材料与仪器
甲氧苄啶（738-70-5），BePure公司；氨水、乙腈、甲醇、正己烷、甲酸，上海安谱科技股份有限公司；氯化钠、无水硫酸钠，广州化学试剂厂；固相萃取小柱PCX（60 mg，3 mL），天津博纳艾杰尔科技有限公司；ProElut QuEChERS（15 mL）净化管，迪马公司。

超高效液相色谱-串联质谱仪，Waters公司；天平，梅特勒-托利多有限公司；离心机，天美中国科学仪器有限公司；涡旋振荡器，广州绿百草生物科技有限公司；氮吹仪，睿科仪器有限公司。

1.2 实验方法
1.2.1 试料的制备
取500 g鸡蛋，搅拌均匀后装入洁净容器内，密封并做好标识。

1.2.2 固相萃取法
称取2.0 g试样于50 mL离心管中，加入20 mL乙腈，涡旋振荡3 min，超声20 min，10 000 r·min-1离心5 min，转移上清液待净化。

PCX固相萃取小柱用3 mL水和3 mL甲醇活化
后，取备用液过小柱。

依次用3 mL水和3 mL甲醇淋洗，用3 mL 5%氨水-甲醇溶液洗脱，收集洗脱液，35 ℃水浴中浓缩至近干。

用1 mL 50%乙腈水溶液溶解残渣，混匀过0.22 μm有机滤膜过滤后供UPLC-MS/MS测定。

1.2.3 液液萃取法
称取2.0 g试样于50 mL离心管中，加入20 mL乙腈，涡旋振荡3 min，超声20 min，10 000 r·min-1离心5 min，将上清液转移至另一离心管中，加入
20 mL乙腈饱和正己烷涡旋振摇5 min，10 000 r·min-1离心5 min，取乙腈层于35 ℃水浴中浓缩至近干。

用1 mL 50%乙腈水溶液溶解残渣，混匀过0.22 μm有机滤膜过滤后供UPLC-MS/MS测定。

1.2.4 QuEChERS萃取法
称取2.0 g试样于50 mL离心管中，加入20 mL乙腈，涡旋振荡2 min，超声20 min，加入3 g氯化钠和3 g无水硫酸钠，涡旋振荡2 min，10 000 r·min-1离心5 min。

转移上清液于QuEChERS净化管中，涡旋混合1 min，10 000 r·min-1离心3 min，准确吸取
5 mL已净化的提取液于35 ℃水浴中浓缩至近干。

用1 mL 50%乙腈水溶液溶解残渣，混匀过0.22 μm有机滤膜过滤后供UPLC-MS/MS测定。

1.2.5 色谱条件
色谱柱：C18柱（100 mm×2.1 mm，2.6 μm）；流速：0.4 mL·min-1；柱温：40 ℃；进样量：2 μL；流动相：A为0.1%甲酸水溶液，B为甲醇。

梯度洗脱程序：0.00～0.50 min，
95%A；0.51～3.00 min，95%A→5%A；3.01～4.00 min，5%A；4.01～
6.00 min，95%A。

1.2.6 质谱条件
通过电喷雾离子源正离子模式下进行多反应监测，电离电压1.2 kV，源温度150 ℃，雾化气温度400 ℃，锥孔气流速50 L·h-1，雾化气流速
1 000 L·h-1。

1.2.7 标准曲线的配制与基质效应
按1.2.2、1.2.3、1.2.4 3种前处理方法，分别用空白基质溶液与50%乙腈水溶液配制成0.500 μg·mL-1、1.000 μg·mL-1、2.000 μg·mL-1、
5.000 μg·mL-1、10.000 μg·mL-1、20.000 μg·mL-1和50.000 μg·mL-1的基質匹配标准工作溶液和溶剂标准工作溶液。

在相同条件下进行测定，分别建立基质标准工作曲线和溶剂标准工作曲线，通过计算基质效应（Matrix Effect，ME）值，判断基质效应。

公式为ME=（基质匹配标准工作曲线的斜率/无基质标准工作曲线的斜率-1）×100%。

|ME|值大于50%，为强基质效应；|ME|值在20%～50%，为中等基质效应；|ME|值小于20%，为弱基质效应[8]。

1.3 结果处理
实验结果采用MassLynx V4.2软件进行绘图和数据处理。

2 结果与分析
2.1 液相色谱条件的选择
甲氧苄啶呈弱碱性，正离子扫描模式下，在流动相中加入甲酸可提高待测目标化合物的电离效率和改善峰形。

因此本试验考察了0.1%甲酸水溶液-甲醇、0.1%甲酸水溶液-乙腈、水-甲醇和水-乙腈对甲氧苄啶的分离效果、灵敏度及峰形的影响。

结果表明，水相中加入0.1%甲酸可较好地提高检测响应，峰形尖锐对称，保留时间稳定，重复性好。

甲醇极性较乙腈强，在反相液相色谱中甲醇保留强于乙腈，且响应比乙腈高。

因此本文选用含0.1%甲酸水溶液-甲醇溶液作为流动相。

甲氧苄啶的总离子流图如图1。

图1 甲氧苄啶标准溶液的总离子流图
2.2 质谱条件的选择
基于目标物的分子结构和物理化学性质，选择ESI+离子化模式，通过流动注射进样对母离子和子离子进行扫描，优化目标物的锥孔电压与碰撞能量参数，获得母离子、定量离子和定性离子最优质谱参数见表1。

2.3 萃取净化方法的选择
鸡蛋中含有大量的蛋白质和脂肪，特别是磷脂，存在杂质多、基质干扰严重等问题，去除干扰因素是兽药残留检测分析的难题。

本实验对比了阳离子交换固相萃取柱萃取、乙腈饱和正己烷液液萃取和QuEChERS萃取3种不同萃取净化方法。

QuEChERS萃取净化的色谱图有较多杂峰，容易产生干扰，基质效应较大，回收率偏低。

液液萃取法能得到较为满意的除杂效果和回收率，但需要使用大量溶剂，并需要浓缩，费时。

固相萃取法能有效地将干扰组分与目标
物分离，减小杂质干扰，回收率高，重现性好，且不需要使用大量有机溶剂，对环境的污染小。

3种不同萃取净化方法的图谱见图2。

相比较，固相萃取法更有优势。