广西鹅圆环病毒全基因组序列测定

广西鹅圆环病毒全基因组序列测定
曹慧慧;孙文超;郑敏;韦显凯;苏姣秀;蒙振亩;黄宝学;刘棋
【摘要】[目的]解析鹅圆环病毒(Goose Circovirus,GoCV)广西流行毒株的全基因组序列及其遗传进化地位,掌握广西GoCV的流行情况,为今后更有效防控GoCV提供理论依据.[方法]分3段对阳性组织样品中的GoCV全基因组进行PCR扩增、克隆和测序,并对拼接得到的GoCV广西流行毒株全基因组进行核苷酸组成、基因组结构及遗传变异分析.[结果]GoCV广西流行毒株(GXTD254)全基因组长度为1822 nt,编码4个主要开放阅读框:ORFV1(Rep蛋白,293个氨基酸)、ORF V2(37个氨基酸)、ORF C1(Cap蛋白,250个氨基酸)和ORF C2(99个氨基酸),且Rep蛋白较Cap蛋白相对保守.遗传进化分析结果表明,GXTD254毒株与4株浙江永康分离毒株(ZJyk1、ZJyk2、ZJyk3和ZJyk4)、1株浙江象山分离毒株(ZJxs1)的遗传距离最接近,同属于一个遗传分支,但与我国台湾的大多数分离毒株(TW1021024G、TWGB21-9、TW6、TW9、TW8和TW1020111GB)及另外2株浙江象山分离毒株(ZJxs3和ZJxs5)的遗传距离较远.[结论]目前我国流行的GoCV存在多个分支,广西流行毒株与部分浙江分离毒株在亲缘关系上比较接近.
【期刊名称】《南方农业学报》
【年(卷),期】2016(047)001
【总页数】6页(P122-127)
【关键词】鹅圆环病毒;全基因组;序列分析;Rep蛋白;Cap蛋白
【作者】曹慧慧;孙文超;郑敏;韦显凯;苏姣秀;蒙振亩;黄宝学;刘棋
【作者单位】广西大学动物科学技术学院,南宁530005;广西动物疫病预防控制中心,南宁530001;广西大学动物科学技术学院,南宁530005;广西动物疫病预防控制中心,南宁530001;广西动物疫病预防控制中心,南宁530001;广西动物疫病预防控制中心,南宁530001;百色市动物疫病预防控制中心,广西百色533000;田东县动物疫病预防控制中心,广西百色533000;广西动物疫病预防控制中心,南宁530001【正文语种】中文
【中图分类】S858.33
【研究意义】鹅圆环病毒（Goose Circovirus，GoCV）属于圆环病毒科（Circoviridae）圆环病毒属（Circovirus）成员，是无囊膜的二十面体病毒粒子，其直径约20nm，为目前已知的最小鹅源病毒（竺春等，2007）。

与猪圆环病毒（Porcine Circovirus，PCV）和鸭圆环病毒（Duck Circovirus，DuCV）等同属成员相似，GoCV也是一种潜在的免疫抑制病毒，主要侵害宿主的淋巴组织，导致宿主免疫抑制，生长迟缓，且增加继发感染的可能性，给鹅养殖业带来极大的经济损失（Chen et al.，2003）。

因此，加强GoCV的相关研究对确保鹅养殖业健康发展具有重要意义。

【前人研究进展】GoCV最早于1999年由德国学者从患病鹅的病变组织中分离获得（Soike et al.，2004），2001年Todd等首次克隆并测
定了GoCV的全基因组序列。

2003年，我国台湾学者Chen等对GoCV台湾分
离毒株的全基因组进行扩增测序及同源性分析；余旭平等（2005）从因禽流感死
亡的鹅体内检出GoCV，并对该流行毒株的基因组结构及流行病学情况进行分析，结果发现浙江永康株GoCV_yk01全长1821 bp，具有与病毒复制相关的茎环结
构和Rep蛋白保守基序等圆环病毒共有的特征，与德国、我国台湾的流行毒株在
全基因组水平有91％～93％的同源性，在Rep蛋白和外壳蛋白的氨基酸水平有94％～97％的同源性。

此后，Scott等（2006）将间接免疫荧光检测方法应用于
GoCV衣壳蛋白抗体检测；田敬等（2010）建立了针对GoCV的实时荧光定量PCR检测方法；徐雅萍等（2012）成功构建了GoCV全长基因组头尾串联二聚体感染性克隆，且能通过转染鹅体内环化增殖出带标记的GoCV克隆。

【本研究切入点】目前，国内有关GoCV的研究相对较少，尤其是广西，针对该病毒流行病学和遗传变异的研究尚处于空白。

【拟解决的关键问题】依据已发表的GoCV序列设计3对引物，对采自广西百色市的鹅组织样品进行GoCV检测，通过套叠PCR和反向PCR扩增获得全长基因组序列，旨在解析GoCV广西流行毒株的全基因组序列及其遗传进化地位，掌握广西GoCV的流行情况，为今后更有效防控GoCV提供理论依据。

1.1 试验材料
从广西百色市活禽市场采集49份鹅组织样品，包括肺脏、脾脏、肝脏、心脏、肾脏、法氏囊等器官组织，-80℃保存备用。

MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit Ver.4.0、pMD18-T载体、T4 DNA连接酶、各种限制性内切酶、DL2000 DNA Marker均购自宝生物工程（大连）有限公司；DH5α感受态细胞、TIANquick Midi Purification Kit、TIANprep Mini Plasmid Kit购自天根生化科技（北京）有限公司；其他试剂均为国产分析纯。

1.2 引物设计及基因组全长扩增
根据GenBank中已发表的GoCV全基因组序列，合成3对扩增产物首尾重叠的引物（表1）用于GoCV全基因组扩增，所有引物均由英潍捷基贸易（上海）有限公司合成。

1.3 病毒基因组DNA提取
取少量样品组织充分研磨，以无菌PBS（pH 7.4）按1∶5的比例进行匀浆稀释，反复冻融3次后8000 r/min离心10 min，取上清液备用。

采用MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit Ver.4.0按说明进行病毒基因组DNA提取。

1.4 PCR扩增
PCR反应体系25.0 μL：2×Ex Taq Buffer 12.5 μL，上、下游引物（20 pmol/μL）各1.0 μL，基因组DNA模板5.0 μL，以ddH2O补足至25.0 μL。

先用引物对
F1-22/R543进行扩增，阳性样品再以剩余部分基因组的引物对F505/R1261和
F1130/R1821分别进行扩增。

1.5 PCR产物纯化与克隆
切胶回收目的片段，以TIANquick Midi Purification Kit进行回收纯化，目的基
因与pMD18-T载体连接（16℃）过夜，并转化DH5α感受态细胞，然后取转化
菌液均匀涂布于含有氨苄抗性的LB琼脂培养基上，37℃培养过夜。

挑取单菌落培养12 h后少量提取质粒，经酶切鉴定阳性的质粒送至宝生物工程（大连）有限公司进行测序。

1.6 全基因序列分析
以DNASTAR的Seqman进行序列拼接得到GoCV全长基因组序列，利用NCBI BLAST软件分析测序结果，并与国内外主要的GoCV分离参考毒株（表2）进行
核苷酸及其推导氨基酸比对分析，并构建遗传进化树。

2.1 GoCV全长基因组PCR扩增结果
从49份鹅组织样品中仅检出1份阳性样品，检出率为2.04％，并将该毒株命名
为GXTD254。

由图1可以看出，所设计的3对引物均能从阳性样品中扩增获得对应的目的片段（图1），且片段大小与预期结果相符合。

2.2 GoCV测序结果分析
测序结果表明，GXTD254毒株的全基因组长度为1822 nt，GenBank登录号
KT207809。

该基因组包含4个主要的开放阅读框：ORF V1（Rep蛋白，293个
氨基酸）、ORF V2（37个氨基酸）、ORF C1（Cap蛋白，250个氨基酸）及ORF C2（99个氨基酸）。

其中，V1编码复制相关蛋白，C1编码外壳蛋白。

与其他GoCV毒株一样，GXTD254毒株在V1和C1的5'端之间存在一个保守的
TATTATTAC茎环结构（图2中下划线部分），而其他不同代表毒株茎环结构顶部保守序列的第1和第3位碱基略有差异。

茎环结构两侧各有一个6碱基正向重复
的GGCGCC序列，而与Rep蛋白基因间存在两个连续的正向重复七碱基序列GTACTCC（图2方框部分）；七碱基正向重复序列与Rep蛋白间为一个高变异
区域（图2黑底部分）。

鉴于各GoCV毒株间该区域高度变异，推测其与病毒自
身复制的相关性不明显，但又位于与病毒复制相关Rep蛋白起始密码子的上游区域，也有可能只是影响Rep蛋白的表达（竺春等，2007）。

2.3 GoCV各基因片段同源性分析
经全基因组序列同源性比对分析，发现GXTD254毒株与浙江永康分离毒株（ZJyk1、ZJyk2、ZJyk3和ZJyk4）、浙江象山分离毒株（ZJxs1）的核苷酸同源性较高，均在97.0％以上。

基于Cap蛋白氨基酸序列的同源性比对分析，发现GXTD254毒株与浙江永康分离毒株（ZJyk2和ZJyk3）的同源性最高（94.8％），与其他GoCV毒株的差异较明显（表3），说明Cap蛋白变异较大；而基于Rep 蛋白氨基酸序列的同源性比对分析，发现GXTD254毒株与浙江永康分离毒株（ZJyk1、ZJyk2和ZJyk3）、浙江象山分离毒株（ZJxs1）的氨基酸同源性较高，均在98.0％以上，与其他地区分离毒株的氨基酸同源性也在96.0％以上（表4），说明Rep蛋白较Cap蛋白相对更保守。

2.4 GoCV基因组遗传进化树分析
基于GoCV全基因组序列，用MEGA 6.0软件对GXTD254毒株、其他GoCV参考毒株及两株广西分离的DuCV毒株进行遗传进化分析，并绘制遗传进化树（图3），结果显示，GXTD254毒株与4株浙江永康分离毒株（ZJyk1、ZJyk2、
ZJyk3和ZJyk4）、1株浙江象山分离毒株（ZJxs1）的遗传距离最接近，同属于
一个遗传分支，再与Germany2001、Germany2008、TW1、TWGB27-20、ZJxs2、ZJxs4等毒株聚为一个大分支；与两株广西分离的DuCV毒株遗传距离最
远。

随着我国水禽养殖业的迅速发展，危害水禽的疾病也越来越多，且日趋复杂，控制难度不断加大，已成为严重制约水禽规模化养殖生产的难题，究其原因可能与水禽群中广泛存在的免疫抑制性疾病相关（蔡宝祥，2001；余旭平等，2005）。

圆环病毒通常潜伏感染而不引起动物发病，一般侵害宿主体内增殖速度较快的细胞，尤其是淋巴细胞，造成动物生长发育障碍、免疫力下降，易遭受其他疫病的并发或继发感染（万春和等，2010）。

Soike等（2004）首先报道在德国一家大型养鹅场
发生一种生长发育障碍和死亡率很高的圆环病毒感染，并引起机体免疫抑制而继发细菌感染；病鹅主要表现为发育不良、体重下降、羽毛凌乱等，组织病理学检查发现法氏囊、脾脏和胸腺的淋巴细胞减少，其中以法氏囊病变最明显。

此后，英国、我国台湾、匈牙利等地也相继报道了该病毒的存在，从而引起各国的广泛重视。

2005年，余旭平等从浙江永康某鹅场感染禽流感的病死鹅中检测到GoCV的存在，怀疑该病毒能引起其他病原的并发或继发感染，协助水禽流感的暴发流行。

2007年，杨晓伟等在重庆荣昌某鹅场的病死鹅中也检测到GoCV。

目前，广西对GoCV 的研究尚处于空白，缺乏病毒流行病学和遗传变异方面的基础数据。

由于GoCV目前尚无法进行体外培养，其研究主要在于核酸扩增及序列测定。

本
研究采用PCR首次从广西本地鹅组织中检出GoCV，检出率为2.04％。

经测序发现，GXTD254毒株全基因组序列包含4个主要的开放阅读框，其中ORF V1编码与病毒复制相关的Rep蛋白，ORF C1编码病毒的衣壳蛋白。

与参考毒株进行同
源性比对分析，发现Rep蛋白氨基酸序列相对保守，各毒株间的氨基酸同源性均
在96.0％以上；但不同毒株间Cap蛋白氨基酸序列差异较明显，同源性最低的只有69.7％，可能与病毒需要适应宿主免疫系统有关。

对病毒Rep和Cap基因5'
端间隔区序列进行比对分析，发现GXTD254毒株与其他GoCV毒株一样，存在
一个保守的TATTATTAC茎环结构，但圆环病毒其他不同代表株茎环结构顶部保
守序列的第1和第3位碱基略有差异，与Phenix等（2001）的研究结果一致。

此外，在茎环结构与Rep蛋白基因间存在两个连续的正向重复七碱基序列（GTACTCC），在茎环结构两侧还各有一个正向重复的GGCGCC序列。

茎环结
构周围的这些重复序列有可能与病毒复制有关，是圆环病毒Rep蛋白的结合位点（Mankertz et al.，1997，2000；Niagro et al.，1998；Todd et al.，2001）。

由构建的遗传进化树可知，GXTD254毒株与4株浙江永康分离毒株（ZJyk1、ZJyk2、ZJyk3和ZJyk4）、1株浙江象山分离毒株（ZJxs1）的遗传距离最接近，同属于一个遗传分支，但与我国台湾的大多数分离毒株（TW1021024G、
TWGB21-9、TW6、TW9、TW8和TW10 20111GB）及另外2株浙江象山分离毒株（ZJxs3和ZJxs5）的遗传距离较远，说明目前我国流行的GoCV存在多个分支，进而给GoCV防控工作提出了新难度。

目前我国流行的GoCV存在多个分支，广西流行毒株与部分浙江分离毒株在亲缘
关系上比较接近，因此可借鉴其成功的GoCV防控经验。

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