鸡毒害艾美尔球虫早熟耐药株的诱导及生物学特性研究(原件)

鸡E.necatrix早熟耐药株的诱导及生物学特性研究摘要为了研制既具有良好的免疫原性，又不受具有抗球虫作用的抗菌类药物影响的高效球虫疫苗，以鸡E.necatrix早熟株（P8）为母株，采用药物浓度递增法，诱导出对土霉素、制菌磺的早熟耐药株，进一步交叉耐药性诱导获得交叉早熟耐药株，测定了早熟耐药株的致病性、内生发育、繁殖力和免疫原性，并对早熟耐药株的免疫特性进行了研究。

试验结果表明：（1）用E.necatrix P8为母株，成功诱导出对土霉素1600mg/kg饲料产生抗药性的毒害艾美耳球虫株，对制菌磺2000mg/kg饲料产生抗药性的毒害艾美耳球虫株，通过交叉耐药诱导获得对制菌磺1800mg/kg饲料及土霉素1600mg/kg饲料均产生抗药性的交叉早熟耐药虫株。

（2）将E.necatrix早熟耐药株与P8、P0的生物学特性进行比较，结果表明：①早熟耐药株攻毒剂量小于5×10 4个/只时，无血便，病变轻微，小于21×10 4个/只时不引起鸡只死亡，早熟耐药株、P840×10 4个/只时致病力与P013×10 4个/只的致病力相当，死亡率分别为43.33%、53.33%、40%，；②接种早熟耐药株72h第一代裂殖体发育成熟，96h出现成熟的第二代裂殖体，108h数量达到高峰，第一、二代裂殖体与P8大小无明显差异，较P0出现早且变小，120裂殖体数量下降，至132h左右可见大、小配子体、及少量合子；在140.5h的盲肠粘膜涂片上有卵囊形成，在156h时卵囊产量达高峰，比P0提前；③接种剂量0.5×104个/只时，早熟耐药株达到产卵高峰，当接种大于0.5×104时产卵总量呈现下降趋势，每个卵囊的繁殖力则随着接种剂量的增加而减少；剂量0.01×104个/只时每个卵囊的繁殖能力最大，早熟耐药株的繁殖能力分别是P8和P0的88.74%、58.35%；④用300个/只孢子化早熟耐药株卵囊免疫7日龄雏鸡，免疫后14d 以以1×104个P0孢子化的卵囊进行攻毒，早熟耐药株卵囊减少率为79.77%；以10×104个P0孢子化的卵囊进行攻毒早熟耐药株病变记分降低率为78.42%，且平均病变记分≤1，血便记分≤1，鸡只无死亡，与P8、P0的免疫力相当。

总体看来，早熟耐药株的生物学特性与P8无明显差异，与P0差异显著，其致病性大大降低，繁殖力有所减弱，且保持了免疫原性不变的特点。

（6）为确定E.necatrix早熟耐药株的最小免疫剂量，以不同剂量对雏鸡于4日龄进行了一次和14日龄二次免疫，结果表明：①免疫剂量越大，产生的免疫保护力越大，对雏鸡体增重的不良影响也越大。

一次免疫剂量200个/只和二次免疫剂量400个/只，可达良好的免疫保护效果，确定为最小免疫剂量；②以最小免疫剂量分别对雏鸡进行一次免疫和二次免疫，分别于免疫后第7d、3d可获得完全保护，能够抵抗P0的攻击；③饲料中添加浓度为1800mg/kg制菌磺和1600mg/kg土霉素时，最小免疫剂量为首免300个/只，二免600个/只。

（4）E.necatrix早熟耐药株于4℃条件下保存，保存15个月时卵囊仍然有活力，随着保存时间的延长，卵囊活力逐渐降低，平均每个月卵囊活力下降6.13%。

E.necatrix早熟耐药株作为疫苗株保存1年时，最小免疫剂量为首免800个/只，二免1600个/只。

关键词：E.necatrix亲本株（P0）；早熟株（P8）；早熟耐药株；土霉素；制菌磺；生物学特性；疫苗特性；前言鸡球虫病是球虫卵囊寄生于鸡肠道黏膜上皮内引起的一种原虫病[1]，是造成现代养禽业经济损失最大的疾病之一，全球每年因该病引起的损失高达80亿美元[2]，我国年养肉鸡数为30亿羽～60亿羽，每年用于抗球虫药的费用高达6亿～18亿元人民币[3]。

报道的有9种球虫，其中作为病原体而引起重视的有柔嫩艾美耳球虫(E.tenella)、毒害艾美耳球虫（E.necatrix）、堆型艾美耳球虫（E.acervulina）、巨型艾美耳球虫（E. maxima）、布氏艾美耳球虫（E. brunetti）五种，其中毒害艾美尔球虫（E.necatrix）是9种鸡球虫中致病力最强的虫种之一，其无性生殖阶段可导致鸡的中后段肠上皮细胞大量破坏和严重出血，影响营养物质的吸收并易引起继发性坏死肠炎，常导致巨大的经济损失[4]。

目前，在养鸡业中，现阶段防治鸡球虫病的主要手段是使用抗球虫药进行化学防治。

化学防治对控制鸡球虫病的爆发和流行、减少养鸡业的经济损失起到了十分重要的作用。

但是，药物防治面临着日益严重的三大问题的困扰：耐药虫株的迅速出现[5,6]，几乎所有的抗球虫药均有耐药虫株的出现，且表现出对与该药同类或作用机理相同的其他药物产生一定程度的交叉耐药性[7]；药物残留问题，在日益关注食品安全背景下，无残留食品的生产将是新世纪现代人追求的目标[8]；对免疫力产生抑制。

当前，世界上已有多种疫苗问世，包括强毒株和弱毒株卵囊及基因工程苗。

但国内外使用的球虫疫苗大都有各自难以克服的缺点：强毒苗致病力较强，免疫时易引发球虫病，且对饲料报酬、增重影响较大；鸡胚致弱株在回归鸡体传代后毒力可能会返强，且常见的九种球虫中只有柔嫩艾美耳球虫等四种可通过鸡胚传代；理化致弱株是真正的致弱株还是活卵囊减少而使致病力降低这一疑问尚未得到证实，因随着传代的增加，其致病性将会恢复；在基因工程苗的研制中，尚未发现对鸡具有完全保护力的球虫抗原基因，因球虫的抗原很复杂，保护性抗原不是一种，而是由各阶段虫体所具有的保护性抗原共同组成，因而克隆出的单一重组抗原只具有部分保护性。

因此这些疫苗的使用都在一定程度上受到了限制。

早熟株具有遗传上稳定、致病力大大降低，对饲料报酬、增重影响较小，可诱导机体产生坚强的免疫力和保护力等特点，因而其使用范围越来越广，如Paracox、Livacox，但进口疫苗价格较高，在中小型鸡场推广较难。

目前国内的早熟弱毒活苗免疫效果还不稳定，对鸡增重有一定影响，且免疫前2周及接种后3周内禁用多种有抗球虫作用的药物，包括禁用具有抗菌作用的抗球虫药，否则免疫会失败，由于具有抗菌作用的抗球虫药禁用而影响对鸡的细菌性传染病的防治，从而造成严重经济损失，因而在我国养鸡生产中还没能得到广泛应用。

郑明学等（2004）通过早熟耐药选育技术获得了柔嫩艾美耳球虫早熟耐药株，研制成功了不受具有抗球虫作用的抗菌药物影响的柔嫩艾美耳球虫疫苗，该疫苗解决了现有球虫疫苗受具有抗球虫作用的抗菌药限制的难题，通过连续传代未发现虫株返强现象，为鸡球虫病的防制开辟了一条崭新的途径。

因此，利用现有技术条件，通过早熟选育法诱导耐药虫株，研制多价球虫疫苗是目前预防及球虫病的有效途径。

1鸡球虫耐药性的研究进展自Levine[12]发现磺胺类药物对鸡球虫病有疗效，Grumbles[13]首先用磺胺喹噁啉药预防鸡球虫病以来，又陆续发现其他药物如呋喃类、生物碱类、离子载体类等药物都能用来防治球虫病。

已报道的抗球虫药达50余种，其中一些药物由于毒性太大或疗效不佳而被淘汰。

1.1抗球虫药物的作用机制1.1.1干扰虫体生物膜离子转运的药物离子载体类抗生素是目前应用最广泛的抗球虫药,如莫能菌素,盐霉素,拉沙里菌素,马杜拉霉素以及海南霉素等。

离子载体类抗生素能穿过细胞膜,影响离子转运。

这些药物在子孢子或裂殖子等穿入宿主细胞之前被吸收,可与Na+，K+,Ca2+,Mg2+等在虫体内起重要作用的阳离子结合形成脂溶性络合物，协助阳离子进入虫体内，导致生物膜两边的Na+，K+，Ca2+，Mg2+等阳离子梯度变化，破坏细胞内外的正常离子平衡，使细胞内外形成渗透压差,大量水分进入，使虫体细胞破裂死亡。

土霉素[14,15]是广谱抗生素，广谱抗菌药，对革兰氏阳性和阴性菌都有作用。

常用于鸡白痢、鸡伤寒、禽霍乱、慢性呼吸道病、球虫病、螺旋体病、大肠杆菌病等。

它主要抑制蛋白质合成时的肤链延长，此外它还可以阻止己合成的蛋白质肤链释放，作用于球虫的第1, 2代裂殖体，预防量0. 02%，治疗量0. 02%+0.18钙，作用峰期为感染后第2, 3天。

1.1.2影响辅酶吸收和合成的药物磺胺类是第一个被广泛用于防治球虫病的药物。

磺胺类通过阻断叶酸合成途径阻止球虫的正常发育。

磺胺类药物的基本化学结构与对氨基苯甲酸相似,可与氨基苯甲酸竞争二氢叶酸合成酶，同时还可抑制二氢叶酸合成酶的活性，妨碍二氢叶酸的合成，最终影响核蛋白的合成，从而抑制了球虫细胞的生长发育。

具有相似机制的药物还有：乙氧乙胺苯甲酯，乙胺嘧，二甲氧甲基苄胺嘧啶（OMP），三甲氧苄胺嘧啶（TMP）等。

制菌磺[14,16]属于磺胺类抗菌药，常用于呼吸道和消化道的细菌性感染，也可用于球虫病的防治。

它可与对氨基苯甲酸竞争二氢叶酸合成酶，影响二氢叶酸的合成，最终阻碍核蛋白的合成，使球虫细胞的生长发育受到抑制，作用于第2代裂殖体，预防量0. 02%，治疗量0. 05%，作用峰期为感染后第4天。

1.1.3抑制虫体线粒体功能的药物喹诺啉类通过阻断虫体线粒体的电子转运，抑制柔嫩艾美耳球虫的呼吸作用，使球虫不能正常发育。

实验表明，喹诺啉类在电子转动链中的作用位点位于辅酶Q与细胞色素b之间。

氯羟吡啶也影响球虫电子转运过程，但与喹诺啉类的作用机制不同，这可能是作用位点不同所致。

Fry（1984）[17]研究指出，球虫线粒体的电子转运存在两种不同终端氧化酶的生化途径，一条途径对低浓度的癸氧喹酯敏感，其可能存在一对癸氧喹酯具有高亲和力的位点；另一条生化途径终止于细胞色素氧化酶，而球虫对氯羟吡啶的耐药性与aa3型细胞色素氧化酶使电子发生转向有关，认为氯羟吡啶可能作用于这条生化途径。

1.1.4作用于虫体类质体的药物地克珠利和百球清可在不对宿主细胞产生影响的药物浓度下，使虫体内质网扩张并空泡化，它们还可抑制球虫磷酸合成中心PSⅡ的重要组成成分D1蛋白质的功能。

D1蛋白质与低氧状态的电子传递有关，有可能提供虫体氧自由基，使其更容易侵入宿主细胞。

1.1.5抑制核酸合成的药物核苷类似物，如氟腺嘌呤等嘌呤类抗球虫药，主要影响虫体对嘌呤核嘧啶的利用，最终使核酸合成减少，使虫体的生长繁殖受阻。

磺胺类药物可通过抑制嘌呤和嘧啶的合成，使核酸合成障碍而发挥抗球虫作用。

1.2耐药性的产生机制现代理论认为，耐药性的产生是在药物的选择压力下，由原本据存于球虫群体中的突变个体多次重复选择的结果。

自发现球虫的耐药性以来，许多学者就其产生机制从细胞、亚细胞水平、代谢水平及分子水平三方面进行了深入研究[18]。

1.2.1从细胞、亚细胞水平看球虫受到抗球虫药的作用，其内部结构发生一系列变化，线粒体发生膜性漩涡或形成髓鞘样结构，内质网、高尔基体含水量增加，细胞膜及核膜模糊或破损，而在同样的药物浓度下，耐药虫株因虫细胞膜和细胞器已发生结构或功能的改变，能够全部或部分抵御药物对其造成的损伤，不能造成死亡而生存下来。