发酵工程7

7.2 培养基灭菌
表：不同微生物的热阻
微生物 细菌与酵母的营养细胞 细菌芽孢 霉菌孢子 病毒和噬菌体 相对抵抗力 1 3×106 × 2-10 1-5
7.2 培养基的灭菌
• 7.2.1.2 对数残留定律 灭菌方程 对数残留定律(灭菌方程 灭菌方程)
dN − = kN dt
N ln = − kt N0
7.2 培养基灭菌
7.2 培养基 预热
– 70C
• 加热
– 130-140C
• 保温
– 130-140C – 5-10min
• 冷却
7.2 培养基灭菌
7.3 空气的过滤除菌
• 7.3.1 空气的预处理 空气的预处理(pretreatment) – 压缩空气的冷却
7.2 培养基的灭菌
dC − = kd ⋅ C dt
∆E c k d = Ac ⋅ exp(− ) RT
7.2 培养基的灭菌
物 质 叶酸 泛酸 维生素B12 维生素 微生素B1 微生素 嗜热脂肪芽孢杆菌 枯草芽孢杆菌 肉毒梭菌 腐败厌气菌 活化能(J/mol) 活化能 70.3 87.9 96.7 92.1 283 318 343 303
N = N 0 exp(−kt )
7.2 培养基的灭菌
7.2 培养基的灭菌
∆E k = A ⋅ exp( − ) RT
14845 lg k = − + 36.17 T
1 ln = − kD 10
2.303 D= k
7.2 培养基的灭菌
表：几种芽孢杆菌比死亡速率k值 几种芽孢杆菌比死亡速率 值
微生物 枯草芽孢杆菌 梭状芽孢杆菌 嗜热芽孢脂肪杆菌 比死亡速率k(s 比死亡速率 -1) 0.047-0.063 0.03 0.013-0.048
N0 1 t = ⋅ ln k NS
7.2 培养基灭菌
计算时取对热抵抗力较大的芽孢杆菌的k进行计算， 计算时取对热抵抗力较大的芽孢杆菌的 进行计算， 进行计算 可以取2.844×105J/mol，于 这时A取 ， 可以取 × ， 这时 取1.34×1036s-1，∆E可以取 × 是式5-4变为： 是式 变为： 变为
7 灭菌
• 为什么要进行灭菌？ 为什么要进行灭菌？
– 绝大多数工业发酵过程要求纯培养。 绝大多数工业发酵过程要求纯培养。 – 工业发酵原料、水、空气中含微生物。 工业发酵原料、 空气中含微生物。
• 工业发酵原料如淀粉、黄豆饼粉、玉米浆中含微 工业发酵原料如淀粉、黄豆饼粉、 生物，数量可达1× 。 生物，数量可达 ×107个/ml。 • 城市空气中含菌较多，农村空气中含菌较少，一 城市空气中含菌较多，农村空气中含菌较少， 般城市空气中含菌数为3000~8000个/立方米。 立方米。 般城市空气中含菌数为 个 立方米
7.2 培养基的灭菌
灭菌温度/℃ 灭菌时间/min 灭菌温度 ℃ 灭菌时间 100 110 115 120 130 145 150 400 36 15 4 0.5 0.08 0.01
灭菌效果相同
维生素B1破坏量 ％ 维生素 破坏量/％ 破坏量 99.3 67 50 27 8 2 <1
7.2 培养基灭菌
14845 lg k = − + 36.127 T
7.2 培养基灭菌
例：某发酵罐，内装培养基40m3，在121℃下 某发酵罐，内装培养基 ℃ 进行分批灭菌。 进行分批灭菌。设每毫升培养基中含耐热的芽 孢为1× 求理论灭菌时间？ 孢为 ×107个，求理论灭菌时间？ 解：
7.2 培养基灭菌
N 0 = 40 ×10 ×10 = 4 × 10 个
7.2 培养基的灭菌
– 由于微生物死亡的活化能高于营养物质破坏的活 由于微生物死亡的活化能高于营养物质破坏的活 微生物死亡的活化能高于 化能，根据P266的推导，灭菌温度升高时微生 化能，根据 的推导， 的推导 死亡速度的增加倍数高于 高于营养物质破坏速度增 物死亡速度的增加倍数高于营养物质破坏速度增 加的倍数。 加的倍数。 – 因此提高灭菌温度，缩短灭菌时间有利于在取得 因此提高灭菌温度， 同样灭菌效果的前提下减少营养物质的失活。但 同样灭菌效果的前提下减少营养物质的失活。 不可能无限制的提高，因为设备的限制。 不可能无限制的提高，因为设备的限制。需要选 取一个合适的温度。分批灭菌： ℃ 取一个合适的温度。分批灭菌：121℃；连续灭 菌135 ℃。
7 灭菌
• 主要内容
– 常用的灭菌方法 – 培养基的湿热灭菌及灭菌方程 – 空气的过滤除菌
7 灭菌
• 教学目标
– 了解工业灭菌常用的方法。 了解工业灭菌常用的方法。 – 掌握灭菌方程、湿热灭菌时间的计算、空气 掌握灭菌方程、湿热灭菌时间的计算、 的过滤除菌方法、 的过滤除菌方法、以及培养基分批灭菌的操 作过程。 作过程。 – 了解连续灭菌的方法及其优势。 了解连续灭菌的方法及其优势。
– 甲醛、氯气或次氯酸钠、高锰酸钾、环氧乙烷、 甲醛、氯气或次氯酸钠、高锰酸钾、环氧乙烷、 季铵盐(如新洁尔灭等 以及抗生素等。 如新洁尔灭等)、 季铵盐 如新洁尔灭等 、以及抗生素等。
• 射线灭菌
– – – – 紫外线； 紫外线； X射线； 射线； 射线 放射线(Co60照射)； 放射线 照射 ； 高能电磁波。 高能电磁波。
7.2 培养基灭菌
– 分批灭菌的计算
7.2 培养基灭菌
• A）灭菌时间的计算 ） 根据灭菌方程，无论灭菌多长时间， 根据灭菌方程，无论灭菌多长时间，发酵罐内的杂 菌数量都不会降到0。 菌数量都不会降到 。因此在计算灭菌时间时可设定一 个灭菌后杂菌数量的目标值 S，如取 NS为0.001个。 个灭菌后杂菌数量的目标值N 目标值 个 则根据灭菌方程， 的时间为： 则根据灭菌方程，完成灭菌所需 的时间为：
• 空气在被压缩的时候温度会升高
– 空气的除水除油
• 防止影响空气过滤介质； 防止影响空气过滤介质； • 防止油滴进入发酵液而影响发酵。 防止油滴进入发酵液而影响发酵。
7.3 空气的过滤除菌
• 7.3.2 空气的过滤除菌
压缩空气 过滤介质 无菌空气
7.3 空气的过滤除菌
7.3 空气的过滤除菌
7.3 空气的过滤除菌
– 过滤介质
• 绝对过滤介质
– 孔隙小于细菌 孔隙小于细菌
• 深层过滤介质
– 孔隙大于细菌 孔隙大于细菌
本章小结
• 1）五种主要的灭菌方法； ）五种主要的灭菌方法； • 2）灭菌方程、分批灭菌的操作及灭菌时间 ）灭菌方程、 的计算、空气的过滤除菌方法； 的计算、空气的过滤除菌方法； • 3）连续灭菌原理与步骤。 ）连续灭菌原理与步骤。
7.2 培养基的灭菌
• 7.2.2 培养基灭菌温度的选择
– 灭菌过程中，微生物死亡的同时，还营养物 灭菌过程中，微生物死亡的同时， 质的破坏，如： 质的破坏，
• 葡萄糖焦化变色； 葡萄糖焦化变色； • 葡萄糖与氨基酸或蛋白质发生反应； 葡萄糖与氨基酸或蛋白质发生反应； 质发生反应 • 蛋白质部分基团发生变化。 蛋白质部分基团发生变化。
7.2 培养基灭菌
7.2 培养基灭菌
• 80℃后，从放料管、取样管和空气管同时通入蒸 放料管、取样管和空气管同时通入蒸 ℃ 气继续加热， 控制进出气阀门继续加热 继续加热； 气继续加热，110 ℃后控制进出气阀门继续加热； • 120 ℃后，开启接种、补料等管道进行排气，并调 开启接种、补料等管道进行排气， 接种 等管道进行排气 节阀门使进气量略大于排气量，维持罐温恒定； 节阀门使进气量略大于排气量，维持罐温恒定； 进气量略大于排气量 罐温恒定 • 保温结束后，依次关闭排气和进气阀门，待罐内 保温结束后，依次关闭排气和进气阀门， 排气和进气阀门 压力低于空气压力后通入无菌空气 后通入无菌空气， 压力低于空气压力后通入无菌空气，维持罐内一 正压； 定的正压 定的正压； • 通入冷却水降温。 通入冷却水降温。
7 灭菌
• 工业发酵的灭菌内容
– 环境的消毒； 环境的消毒； – 培养基和设备灭菌； 培养基和设备灭菌； – 空气过滤除菌； 空气过滤除菌； – 在发酵过程中维持正压，如将罐压维持在 在发酵过程中维持正压， 0.05Mpa。 。
7.1 常用的灭菌 消毒 方法 常用的灭菌(消毒 消毒)方法
化学药剂灭菌
6 7 7
N S = 0.001个
14845 14845 lg k = − + 36.127 = − + 36.127 = −1.55 T 273 + 121
7.2 培养基灭菌
k = 0.0281s
−1
N0 1 1 4 ×10 t = ⋅ ln = ⋅ ln = 1442.6 s k N S 0.0281 0.001
THANKS FOR YOU ATTENTION!
14
7.2 培养基灭菌
• B）分批灭菌的热量计算 略) ）分批灭菌的热量计算(略
7.2 培养基灭菌
• 7.2.3 连续灭菌过程 连续灭菌过程(continuous sterilization process)
– 升温速度快，灭菌温度高，灭菌时间短，对培 升温速度快，灭菌温度高，灭菌时间短， 养基的破坏小； 养基的破坏小； – 降温速度快； 降温速度快； – 蒸汽的用量省。 蒸汽的用量省。
7.2 培养基的灭菌
• 7.2.1 湿热灭菌的原理
– 7.2.1.1 微生物的热阻
• 微生物对高温的抵抗能力为微生物的热阻。 微生物对高温的抵抗能力为微生物的热阻。 对高温的抵抗能力为微生物的热阻 • 高温下，微生物细胞内的蛋白不可逆变性，微生物 高温下，微生物细胞内的蛋白不可逆变性， 死亡。 死亡。 • 一般微生物 ℃，10min可杀死；耐热的芽孢 一般微生物60℃ 可杀死； 可杀死 耐热的芽孢100℃， ℃ 数分钟至数小时才能杀死；少数嗜热菌 ℃，20嗜热菌120℃ 数分钟至数小时才能杀死；少数嗜热菌 30min才死。 才死。 才死