毛细管电泳-激光诱导荧光法测定缺氧缺血新生大鼠脑组织中氨基酸

其中 Y 为电泳色谱峰面积，X 为样品的浓度（ µg / L）（ Y area of peak，X concentration of aample）。
相关系数 Correlation coefficient
（ r）
0. 9971
0. 9978
0. 9979
3. 3 准确度与精密度 按照线性关系项下操作，于日内、日间分别测定 L-谷氨酸、L-天门冬氨酸和甘氨酸加入量为 0. 10、
按照实验方法确定的最佳条件下，进行线性关系确定，精密量取配制一系列 L-谷氨酸、L-天门冬氨 酸和甘氨酸对照品的溶液 50 µL，于 60℃ 水浴下 N2 吹干，然后加入均匀的大鼠对照组的脑组织匀浆液 1. 0 mL，按照样品处理方法处理，并沉淀蛋白，经衍生化后测定 L-谷氨酸，L-天门冬氨酸和甘氨酸峰面 积，减去对照脑组织（1. 0 mL）的对应峰面积，根据峰面积的差值（ Y）和浓度（ X）求得线性回归方程，其 结果如表 1。
运行缓冲液：40 mmol / L 硼砂溶液；分离电压：20 kV；压力进样：5 s；分离时间：15 min；分离温度： 20℃ ；488 nm 氩离子激光诱导荧光检测器检测。 2. 3 实验动物和 HIE 模型制备
7 日龄新生 SD 大鼠 32 只，雌雄不拘，体重 12 ～ 16 g，由兰州军区总医院动物实验中心提供。参照 文献［10］的方法，7 日龄 SD 大鼠吸入乙醚麻酸后，固定四肢、头部，酒精消毒，切开颈部皮肤，分离右颈 总动脉，O 号线结扎，恢复 2 h；将动物放入 37℃ 水浴箱的低氧缸内，通入氧气（ 占 8% ）和氮气（ 占 92% ）
Y = 6. 271 × 107 X + 3. 679 × 107 Y = 8. 691 × 107 X - 178 × 107
Y = 7. 137 × 107 X - 2. 038 × 108
线性范围 Linear range （ µg / L）
8. 25 ～ 132
9. 0 ～ 144
4. 75 ～ 76
（1 兰州军区兰州总医院临床药理基地，兰州 730050） （2 军事医学科学院毒物研究所，北京 100850） （3 兰州大学第一医院儿科，兰州 730000）
摘 要 建立了新生儿缺氧缺血性脑病（ HIE）发生时脑组织中兴奋性氨基酸（ EAA）含量的高效毛细管电泳激光诱导荧光检测（ CE-LIF）的新方法。方法的最佳条件为：40 mmol / L 硼砂溶液，分离电压 20 kV，压力进样 5 s，λem = 488 nm、λex = 560 nm。随 机 分 为 假 手 术 组、新 生 儿 缺 氧 缺 血 性 脑 病（ HIE）组，小 剂 量 地 塞 米 松 （DXM）组和大剂量 DXM 组的新生大鼠脑组织中 EAA 的含量测定，结果表明：假手术组 EAA 含量较低，HIE 组 EAA 含量显著升高，大、小剂量 DXM 预处理后，EAA 含量较 HIE 组有不同程度的降低。
酸和甘氨酸含量的脑组织中分别加 入 L-谷氨酸、L-天门冬氨酸和甘氨 酸量 为 0. 10、0. 50 和 1. 00 mg / L 后，按照 标 准 曲 线 项 下 的 处 理 方 法 操作后，用 毛 细 管 电 泳 进 行 测 定 样 品中 3 种氨基酸的含量，用加入氨
表 3 脑组织中氨基酸的回收率（ n = 5）
2 实验部分
2. 1 仪器与试剂 P / ACE system5000 毛细管电泳仪，毛细管 75µm（ i. d）× 47cm，有效长度 37 cm（ 美国 Beckman 公
司）；氩离子激光诱导荧光检测器（ λem = 488 nm，λex = 560 nm）（ 美国 Beckman 公司）；PHS-3C 酸度计 （ 上海雷磁仪器厂）；AS5150 超声波清洗器（ AUTOSCIENCE 仪器有限公司）。L-谷氨酸（ L-Glu）、L-天门 冬氨酸（ L-Asp）、甘氨酸（ Gly）均为高纯度试剂（ 加拿大 Bio Basic Inc 公司），其余试剂均为分析纯。 2. 2 实验条件
关键词 高效毛细管电泳-激光诱导荧光检测法，缺氧缺血新生大鼠，脑组织，氨基酸
1引 言
新生儿缺氧缺血性脑病（ HIE）是围产期各种因素引起缺氧缺血导致的脑部损伤，病死率及致残率 很高，是新生儿时期造成脑瘫的主要原因之一［1］。其发病机理复杂，尚无理想的防治措施。研究证实， 缺氧缺血时兴奋性氨基酸（ EAA）大量释放，造成细胞内钙超载和氧自由基生成增多。关于 HIE 的治 疗，文献［2，3］报道主要应用地塞米松（ DXM）进行脑损伤的防治。由于脑组织中 EAA 含量低、且样品 量少，新生儿患 HIE 时，地塞米松是否在有效血药浓度下抑制 EAA 的释放，必须准确地分析 HIE 时脑 组织中的 EAA 含量才能予以确认。近年来，运用高效毛细管电泳（ CE）测定大鼠血浆［4］、大鼠导水管周 围灰质微透析液中［5］、白内障晶状体［6］、鼠脑微透析液［7 ～ 9］及其它组织［10，11］中氨基酸已有文献报道，同 时也有其它 CE 技术对氨基酸进行了分析［12，13］，而对脑组织中氨基酸的测定未见文献报道。本研究建 立了测定缺氧缺血新生大鼠脑组织及通过 DXM 防治后新生大鼠脑组织中 EAA 含量的高效毛细管电 泳-激光诱导荧光（ CE-LIF）方法，为进一步探讨不同剂量 DXM 在 HIE 时的脑损伤研究提供理论依据。
第 34 卷 2006 年 4 月
分析化学（ FENXI HUAXUE） 研究简报 Chinese Journal of Analytical Chemistry
第4 期 543 ～ 546
毛细管电泳-激光诱导荧光法 测定缺氧缺血新生大鼠脑组织中氨基酸
王 荣#1，2 贾正平1 阮金秀2 王宝宏3 马 骏1 谢 华1 费改顺1 张 强1 郭志强1 王 娟1
按规定时间将动物处死，迅速取脑，取右额顶部皮质精确称重，按重量比加入 0. 4 mol / L HClO4 ，手 动匀浆器匀浆，4℃ 离心 10 min（3000 r / min），取上清液衍生。
取一定量的待测样品，加入过量浓度为 2. 5 × 10 - 3 mol / L 荧光素异硫氰酸酯（ FITC）的丙酮溶液（ 加 入的 FITC 的量为待测样品中氨基酸总量的 8 ～ 10 倍），加入丙酮，使 FITC 和丙酮的体积和为 400 µL， 再加入 2 滴 0. 5% 丙酮-吡啶溶液，最后加入 40 mmol / L，pH = 9. 3 的硼砂缓冲液至 1 mL，在（40 ± 0. 5）℃ 下避光恒温 12 h。进样，用高效毛细管电泳仪测定 Glu、Asp、Gly 的含量。 2. 6 统计学分析
0. 10 0. 50
3. 8 4. 6 4. 2 5. 0
6. 3 3. 9 5. 3 4. 8
7. 0 6. 1
1. 00
3. 5 2. 9
平均
6. 8 5. 7
3. 8 4. 2
Average
4. 2 5. 3 5. 3 4. 7
5. 6 6. 2 6. 5 6. 0
3. 4 提取回收率 在已知 L-谷氨酸、L-天门冬氨
RSD （% ）
0. 10
90. 1
5. 3
91. 2
5. 6
93. 4
5. 9
0. 50
92. 5
6. 8
96. 0
4. 6
94. 2
5. 6
1. 00
93. 5ຫໍສະໝຸດ 5. 693. 2
5. 2
95. 6
4. 2
平均 Average 92. 0
5. 9
93. 5
5. 1
94. 4
5. 2
基酸后测定脑组织中的氨基酸的含量减去已知氨基酸含量脑组织中氨基酸的含量与加入 3 种氨基酸量
Table 3 Extraction recovery of Glu，Asp and Gly in brain（ n = 5）
加入量
Added （ mg / L）
L-Glu
回收率
Recovery （% ）
RSD （% ）
L-Asp
回收率
Recovery （% ）
RSD （% ）
L-Gly
回收率
Recovery （% ）
32 只新生大鼠随机分为 4 组，每组 8 只。第 1 组为假手术组，单纯游离右颈总动脉，不结扎，不缺 氧；第 2 组为 HIE 组，单纯缺血、缺氧，不给药物干预；第 3 组为小剂量 DXM 组，造模前 30 min 腹腔注射 DXM（0. 5 mg / kg）；第 4 组为大剂量 DXM 组，造模前 30 min 腹腔注射 DXM（10 mg / kg）。所有动物均于 造模后 2 h 断头取样。 2. 5 脑组织样品处理和衍生步骤
L-Asp、Gly 的电泳峰。根据分离要求，分别选择 Na2 HPO4 、KH2 PO4 和 Na2 B4 O7 作为缓冲液。结果发现： 以 Na2 B4 O7 作为缓冲液时分离氨基酸的结果较其它缓冲液良好。因此，进一步考察了 Na2 B4 O7 作为缓冲 液的浓度（10 ～ 60 mmol / L）及 pH（2. 5 ～ 10. 9）对氨基酸分离的影响，结果表明：Na2 B4 O7 作为缓冲液在 pH 为 9. 3，浓度为 40 mmol / L 时，分离结果良好。
分离过程中考察了分离温度对分离的影响。当温度从 15℃ 上升至 30℃ 时，分离效果变差，这主要 与焦耳热的产生有关，故以 20℃ 为分离温度。此外，分离电压从 5 kV 增加至 30 kV 时，氨基酸的分离度 虽略有下将，但分离时间缩短，因此，选择 20 kV 作为最佳分离电压。 3. 2 线性关系
0. 50 和 1. 00 mg / L 的对照品脑组织样品，计算日内、日间方法的准确度和精密度，结果见表 2。
第4 期
王 荣等：毛细管电泳-激光诱导荧光法测定缺氧缺血新生大鼠脑组织中氨基酸