分子克隆方法之同源克隆方法(20160115)

质粒同源序列
5’ 3’
PCR扩增出含质粒同源序列的目的基因片段
3’ 5’
单片段克隆原理图二
PCR产物纯化 5’ 3’ 3’ 5’ 3’ 5’ 5’ 3’
+
目的载体线性 化（PCR或酶 切）及纯化
线性化载体
3’--->5’外切酶活性
同源反应示意图
目的质粒
PCR反应体系(以Takara PrimeSTAR为例)
*已线性化质粒： pCDH‐EF1‐MCS‐IRES‐neo PCDNA3.1+ pcDNA6myc-His_A pDsRed-Monomer-C1 pEGFP-N1 pGEX-6P-1 …
从头合成质粒 之 多片段克隆
多片段克隆流程图
从cDNA PCR获取包含目的片段1
含目的片段1的质粒
用包含同源序列的引物做PCR 扩增出含同源序列的片段1
同源反应示意图
目的质粒
第三轮及之后PCR线性化示意图
PCR反应体系(以Takara PrimeSTAR为例)
PCR反应体系(Takara PrimeSTAR)
PrimeSTAR Max Premix（2×） 25μL Primer 1 1μL Primer 2 1μL ddH2O 22.5μL Template 0.5μL Total 50μL
*同源反应37℃ 30min，后置于冰上 5min
*同源反应产物全部用于转化 100μL感受态细菌 (慢病毒载体需要用Stbl3感受态)
*同源反应产物可保存于-20℃
同源反应体系(简便版)
5×CE II Buffer PCR所得线性化质粒 Exnase® II Total 2 μl 7μl 1 μl 10μl
ddH2O 5×CE II Buffer PCR所得线性化质粒 Exnase® II Total Up to 10 μl 2 μl 25～200 ng 1 μl 10μl
*同源反应37℃ 30min，后置于冰上 5min
*同源反应产物全部用于转化 100μL感受态细菌 (慢病毒载体需要用Stbl3感受态)
*同源反应37℃ 30min，后置于冰上 5min
*同源反应产物全部用于转化 100μL感受态细菌 (慢病毒载体需要用Stbl3感受态)
*同源反应产物可保存于-20℃
*已线性化质粒： pCDH‐EF1‐MCS‐IRES‐neo PCDNA3.1+ pcDNA6myc-His_A pDsRed-Monomer-C1 pEGFP-N1 pGEX-6P-1 …
已有质粒改造 之 插入片段
质粒插入片段流程图
以质粒为模版用包含同源序列的 引物做PCR，扩增得到线性质粒
PCR产物纯化
同源反应
目的质粒 转化
质粒插入片段原理图一
引物（实线） 需插入区域（渐变色）
第一轮PCR示意图
第二轮PCR示意图
第二轮PCR线性化示意图
质粒插入片段原理图二
第三轮及之后PCR示意图
PCR仪设置 98℃ 10s 55℃ 5s 30-35Cycles 72℃ 30s/kb 72℃ 30s/kb 12℃ +∞ *扩增条带特异时无需切胶回收， 可直接用DNA纯化试剂盒纯化
同源反应体系（Vazyme产品）
同源反应体系(标准版)
ddH2O 5×CE II Buffer 线性化克隆载体 插入片段扩增产物 Exnase® II Total Up to 10 μl 2 μl 25～100 ng 10～100 ng 1 μl 10μl
+
目的载体线性化（PCR 或酶切）及纯化
同源反应 目的质粒
转化
单片段克隆原理图一
cDNA 5’ CDS区域 AAA… 3’ PCR获取包含目的基因CDS序列的片段 目的基因片段
质粒
与基因互补序列 （18-27bp） 正向引物(实线)
目的基因片段 5’ 3’ 反向引物(实线)
3’
5’
质粒同源序列 （15-20bp）
片段1 PCR产物 纯化
+
片段2 PCR产物 纯化
+
片段3 PCR产物 纯化
+… +
目的载体线性化 （PCR或酶切） 及纯化
同源反应 目的质粒
转化
多片段克隆原理图（方法一）---更适用于单个位置突变数较多
引物设计 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 3’ 5’ 5’ 3’ 3’ 5’ 突变位点设计在同源序列内 3’ 5’ 3’ 5’
目的质粒
第三轮及之后PCR线性化示意图
PCR反应体系(以Takara PrimeSTAR为例)
PCR反应体系(Takara PrimeSTAR)
PrimeSTAR Max Premix（2×） 25μL Primer 1 1μL Primer 2 1μL ddH2O 22.5μL Template 0.5μL Total 50μL
*建议模版量小于10ng (尤其是模板为含目的基因片段的质粒)
PCR仪设置 98℃ 10s 55℃ 5s 30-35Cycles 72℃ 30s/kb 72℃ 30s/kb 12℃ +∞ *扩增条带特异时无需切胶回收， 可直接用DNA纯化试剂盒纯化
同源反应体系（Vazyme产品）
同源反应体系(标准版)
多片段克隆同源反应体系（标准版） ddH2O 5×CE MultiS Buffer 线性化克隆载体 插入片段扩增产物1 插入片段扩增产物2 插入片段扩增产物3 …… Exnase® MultiS Total Up to 10 μl 2 μl [0.01 × 片段碱基对数] ng (0.15 pmol) [0.01 × 片段碱基对数] ng (0.15 pmol) [0.01 × 片段碱基对数] ng (0.15 pmol) [0.01 × 片段碱基对数] ng (0.15 pmol) 1 μl 10μl
分子克隆之同源克隆方法
第一部分---从头合成质粒
单片段克隆 多片段克隆
第二部分---已有质粒改造
突变 缺失 插入
从头合成质粒 之 单片段克隆
单片段克隆流程图
从cDNA做PCR获取包含目 的基因CDS序列的片段
含目的基因片段的质粒
用含有质粒同源序列的引物做PCR扩增 出含质粒同源序列的目的基因片段 PCR产物纯化
+
目的载体线 性化（PCR 或酶切）及 纯化 线性化载体
5’ 3’
3’ 5’
同源反应
目的质粒
PCR反应体系(以Takara PrimeSTAR为例)
PCR反应体系(Takara PrimeSTAR)
PrimeSTAR Max Premix（2×） 25μL Primer 1 1μL Primer 2 1μL ddH2O 22.5μL Template 0.5μL Total 50μL
*同源反应产物可保存于-20℃
同源反应体系(简便版)
5×CE II Buffer PCR所得线性化质粒 Exnase® II Total 2 μl 7μl 1 μl 10μl
已有质粒改造 之 缺失片段
质粒片段缺失流程图
以质粒为模版用包含同源序列的 引物做PCR，扩增得到线性质粒
PCR产物纯化
同源反应
PCR仪设置
98℃ 55℃ 72℃ 72℃ 12℃ 10s 5s 30s/kb 30s/kb +∞ ≤30Cycles
*建议模版量小于10ng
*扩增条带特异时无需切胶回收，可 直接用DNA纯化试剂盒纯化 *扩增效率不佳时，可延长至 ≤35Cycles
同源反应体系（Vazyme产品）
同源反应体系(标准版)
*建议模版量小于10ng
*扩增条带特异时无需切胶回收，可 直接用DNA纯化试剂盒纯化 *扩增效率不佳时，可延长至 ≤35Cycles
同源反应体系（Vazyme产品）
同源反应体系(标准版)
ddH2O 5×CE II Buffer PCR所得线性化质粒 Exnase® II Total Up to 10 μl 2 μl 25～200 ng 1 μl 10μl
已有质粒改造 之 突变
质粒突变流程图
以质粒为模版用包含同源序列的 引物做PCR，扩增得到线性质粒
PCR产物纯化
同源反应
目的质粒
转化
质粒突变原理图一
引物（实线） 需突变区域（渐变色）
第一轮PCR示意图
第二轮PCR示意图
第二轮PCR线性化示意图
质粒突变原理图二
第三轮及之后PCR示意图
同源反应示意图
PCR仪设置
98℃ 55℃ 72℃ 72℃ 12℃ 10s 5s 30s/kb 30s/kb +∞ ≤30Cycles
*建议模版量小于10ng
*扩增条带特异时无需切胶回收，可 直接用DNA纯化试剂盒纯化 *扩增效率不佳时，可延长至 ≤35Cycles
同源反应体系（Vazyme产品）
同源反应体系(标准版)
多个片段PCR 及其产物纯化
+
目的载体线 性化（PCR 或酶切）及 纯化 线性化载体
同源反应
目的质粒
多片段克隆原理图（方法二）---适用于仅多片段融合或单个位置仅一个点突变
引物设计 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 3’ 5’ 3’ 5’ 突变位点设计在同源序列内 3’ 5’
多个片段PCR 及其产物纯化
PCR反应体系(Takara PrimeSTAR)
PrimeSTAR Max Premix（2×） 25μL Primer 1 1μL Primer 2 1μL ddH2O 22.5μL Template 0.5μL Total 50μL
*建议模版量小于10ng (尤其是模板为含目的基因片段的质粒)
目的质粒
转化
质粒片段缺失原理图一
引物（实线） 需缺失区域（紫色）
第一轮PCR示意图
第二轮PCR示意图
第二轮PCR线性化示意图
质粒片段缺失原理图二
第三轮及之后PCR示意图
同源反应示意图
目的质粒
第三轮及之后PCR线性化示意图
PCR反应体系(以Takara PrimeSTAR为例)
PCR反应体系(Takara PrimeSTAR)
ddH2O 5×CE II Buffer PCR所得线性化质粒 Exnase® II Total Up to 10 μl 2 μl 25～200 ng 1 μl 10μl
*同源反应37℃ 30min，后置于冰上 5min
*同源反应产物全部用于转化 100μL感受态细菌 (慢病毒载体需要用Stbl3感受态)
*同源反应37℃ 30min，后置于冰上 5min
*同源反应产物全部用于转化 100μL感受态细菌 (慢病毒载体需要用Stbl3感受态)
*同源反应产物可保存于-20℃
同源反应体系(简便版)
5×CE II Buffer 线性化克隆载体 插入片段扩增产物 Exnase® II Total 2 μl 1μl 6μl 1 μl 10μl
PrimeSTAR Max Premix（2×） 25μL Primer 1 1μL Primer 2 1μL ddH2O 22.5μL Template 0.5μL Total 50μL
PCR仪设置
98℃ 55℃ 72℃ 72℃ 12℃ 10s 5s 30s/kb 30s/kb +∞ ≤30Cycles
*同源反应产物可保存于-20℃
同源反应体系(简便版)
5×CE II Buffer PCR所得线性化质粒 Exnase® II Total 2 μl 7μl 1 μl 10μl
附：其他引物设计方法质粒PCR原理图(不推荐)
引物背靠背设计，无互补区域
引物完全互补反向
引物部分互补相向