等电点电泳 原理 步骤 详细
合集下载
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
2.样品中的成分必须停留在其pI，不适用在pI不 溶或发生变性的蛋白质。
上海交通大学医学院
分辨率(resolution)较不连续PAGE更高， 特别适合于分离分子量(molecuar weight,MW) 相同而电荷(electric charge)不同的生物大 分子。
Q M = ——
6r
上海交通大学医学院
上海交通大学医学院
讲课内容
1
IEFE定义
2
IEFE的特点
3
IEFE的基本原理
4
IEFE的应用
5
血红蛋白的等电聚焦电泳（实验）
上海交通大学医学院
四、IEFE的应用 Applications of IEF
1.分析分离制备蛋白质、多肽 ①区分人血清蛋白 ②测出异常免疫球蛋白 ③基因分型 ④csf中寡克隆区带的检测 2.测定pI可鉴定蛋白质、多肽 3.双相电泳中，IEF作为第一相
干扰样品的测定。
上海交通大学医学院
2.载体两性电解质的合成
加成反应
丙烯酸+多乙烯多胺
Ampholine（LKB）
本质：一系列脂肪族(aliphatic ampholytes)多 氨基多羧酸同系物和异构体，具有很多既不相 同又十分接近相互连接的pI值。
pH范围：pH3~10
上海交通大学医学院
上海交通大学医学院
在电泳介质中放入载体两性电解质(carrier ampholytes) ，当通入直流电时，两性电解质形 成一个由正极(anode)到负极(cathode)逐渐增加 的pH梯度，正极附近是低pH区，负极附近是高pH 区。
上海交通大学医学院
蛋白质分子的电聚焦过程
+
+
pH=pI
-
—
a
b
a. 蛋白质分子在负极端 b. 蛋白质分子在正极端 c. 蛋白质样品中各组分聚焦成区带
讲课内容
1
IEFE定义
2
IEFE的特点
3
IEFE的基本原理
4
IEFE的应用
5
血红蛋白的等电聚焦电泳（实验）
上海交通大学医学院
三、IEFE的基本原理
上海交通大学医学院
蛋白质分子在不同pH下的解离状态
NH3+ P
COOH
pH＜pI pI
NH3+
NH2
P
P
COO-
COO-
pH＝pI
pH＞
上海交通大学医学院
上海交通大学医学院
上海交通大学医学院
进行IEFE必须具备3个条件：
①有一个在电泳条件下基本稳定、重复性良好的 pH梯度
②有一个抗对流的电泳材料，使已经分离的样品 不再重新混合
③电泳后有适当的方法来鉴定分离的区带
上海交通大学医学院
（一）pH梯度的建立
用多种两性电解质(ampholytes)混合物建 立稳定良好的pH梯度
上海交通大学医学院
当环境pH<pH’时，它带正电荷，朝负极移动， 直至移动到它的等电点处，在那里聚集。由于 两性电解质A在它的pI处具有一定的缓冲能力， 因此在它附近形成一个pH稳定区域。
上海交通大学医学院
同样载体两性电解质(carrier ampholytes) 中各种两性电解质也会各自迁移到它们的等电 点(isoelectric point,pI)处，由于它们的数 量足够多，各自的等电点相差很小，从而形成 一个pH梯度。
qqmm66rr上海交通大学医学院讲课内容iefe定义上海交通大学医学院上海交通大学医学院蛋白质分子在不同ph下的解离状态nhcoohcoophpiphpiphpi上海交通大学医学院在电泳介质中放入载体两性电解质carrierampholytes当通入直流电时两性电解质形成一个由正极anode到负极cathode逐渐增加的ph梯度正极附近是低ph区负极附近是高ph上海交通大学医学院蛋白质分子的电聚焦过程phpipi上海交通大学医学院在这个从正极到负极ph逐渐增加的直流电场中当蛋白质进入这个环境不同的蛋白质带上不同性质和数量的电荷向着一定方向移动迁移到与其相同的等电点位置上停留下来即被聚焦于一个狭的区带中得以分离
是在电泳介质中放入载体两性电解质(Carrier ampholyte)，当通以直流电时，两性电解质即
形成一个由阳极到阴极逐步增加的pH梯度，在 此体系中，不同的蛋白质即移动到或聚焦于其 相当的等电点位置上，也就是说被聚焦于一个 狭的区带中，电泳技术中的等电点聚焦也称为 聚焦电泳。
上海交通大学医学院
讲课内容
上海交通大学医学院
㈡引入电场时的变化
载体两性电解质 (carrier ampholytes)分子 将 向 阴 极 (cathode) 或 阳 极 (anode) 迁 移 ，带 有 最低 等 电点的分子（荷最多的负电） 将最快地向阳极迁移。当它 达到净电荷是零的位置时才 停止。
其次一些低pI的载体两 性电解质分子（荷其次多的 负电）也将向阳极移动，直 到它的净电荷被减少到零才 停止。
Isoelectric focusing (IEF), is a technique for separating different molecules by their electric charge differences.
上海交通大学医学院
等电聚焦(Isoelectric focusing ,IEF)就
上海交通大学医学院
[思考题]
1.PAGE与IEFE有何区别？ 2.本实验的关键步骤是什么？
上海交通大学医学院
参考书目
《蛋白质电泳实验技术》 科学出版社 郭尧君 《蛋白质技术手册》 科学出版社 汪家政 范敏 主编 《电泳》 科学出版社 何忠效 张树政 主编
上海交通大学医学院
3.pH梯度的形成
载体两性电解质(Carrier ampholytes)是 一系列不同分子的两性电解质的混合物,在通 电后，它们各自迁移到适当位置形成一个连续 的pH梯度(pH gradient)。
上海交通大学医学院
㈠没通电时的变化
所有的载体两性 电 解 质 (Carrier ampholytes) 分 子 都 荷 电，只是溶液中荷正 电和荷负电的基团数 目 相 等 ， 净 电 荷 (net charge)为零。
1
IEFE定义
2
IEFE的特点
3
IEFE的基本原理
4
IEFE的应用
5
血红蛋白的等电聚焦电泳（实验）
上海交通大学医学院
二、IEFE的特点
（一）优点
High Resolution High Sensitivity Good Reproduction
上海交通大学医学院
（二）缺点
1.要求用无盐溶液，而在无盐溶液中蛋白质可能 发生沉淀。
等电聚焦电泳
Isoelectric Focusing Electrophoresis，IEFE
李莉
http://www.shsmu.edu.cn/
讲课内容
1
IEFE定义
2
IEFE的特点
3
IEFE的基本原理
4
IEFE的应用
5
血红蛋白的等电聚焦电泳（实验）
上海交通大学医学院
一、IEFE 定义
IEFE一种利用具有pH梯度的支持介质分离 等电点（isoelectric point，pI)不同的蛋白 质的电泳技术。
上海交通大学医学院
1.理想的载体两性电解质（Carrier ampholytes） 应具备的特征：
①分子量要小，以便与被分离大分子物质分离； ②化学性质稳定； ③各成分的pI彼此接近，并在其pI值附近有良好
的缓冲能力； ④在pI处具有足够的电导，导电性均匀； ⑤两性电解质载体的数目要足够多； ⑥可溶性好； ⑦对280nm的紫外光没有或仅有很低的吸光度，不
Hb具有四条多肽链 （α、β、γ、δ）
上海交通大学医学院
HbA 正常成人血中主要的Hb成分。 HbA2 正常成人Hb中的一个次要成分，当
胎儿出生时，其浓度不到1%，以后 稍增多，在正常成人中其平均值自 2.2% 至2.6%左右，最高范围一般 不超过3.5%。
上海交通大学医学院wenku.baidu.com
HbF 1866年发现，是胎儿和初生儿的Hb的主要
上海交通大学医学院
㈢电泳结束后的变化 所有的载体两性电解
质(carrier ampholytes) 分子以增加pI级数的办法 将分别在阳、阴极之间到 达它们自己的位置而给出 一个pI梯度。
上海交通大学医学院
上海交通大学医学院
电解槽中，通电后，正负两极都会发生电极反应： 正极端反应：6H2O→O2+4H3O++4e负极端反应：4H2O+4e-→2H2+4OH-
上海交通大学医学院
上海交通大学医学院
上海交通大学医学院
（二）支持介质(medium)的选择 作用：防止扩散
抗对流 liquid medium：蔗糖、Ficoll gel medium：agarose、sephadex、PAG
上海交通大学医学院
（三）聚焦后的检测方法 各种染色法 扫描与定量 其它检测方法
上海交通大学医学院
双向电泳（two-dimensional electrophoresis, 2-DE）
上海交通大学医学院
考马斯亮蓝
银染
上海交通大学医学院
讲课内容
1
IEFE定义
2
IEFE的特点
3
IEFE的基本原理
4
IEFE的应用
5
血红蛋白的等电聚焦电泳（实验）
上海交通大学医学院
实验 血红蛋白的等电聚焦电泳
成分，足月的初生婴儿血中大约有70-80%为 HbF，其余为HbA。婴儿出生后不久，HbF的浓 度迅速减少，同时HbA相应增多，绝大多数正 常人于出生后6个月至2年后，HbF便降至成人 的正常浓度，以后HbF一直存在。
上海交通大学医学院
[器材]
电泳仪 凝胶玻管 三角烧杯 10cm长针头
在负极引起pH值的升高，在正极pH下降， 另外在电极槽的正极端放的是酸性溶液，负极 端放的是碱性溶液造成了在电极附近pH的急剧 变化
上海交通大学医学院
由于载体两性电解质(carrier ampholytes) 是一系列不同分子的两性电解质的混合物所组 成 的 ， 设 其 中 某 一 成 分 为 A， 它 的 pI=pH’， 当 环境中的pH>pH’时，它带负电荷，朝正极移动。
pI1 pI2 pI3 pIn
c
上海交通大学医学院
在这个从正极到负极pH逐渐增加的直流电 场中，当蛋白质进入这个环境，不同的蛋白质 带上不同性质和数量的电荷，向着一定方向移 动，迁移到与其相同的等电点位置上停留下来， 即被聚焦于一个狭的区带中 ，得以分离。
The proteins become focused into sharp stationary bands with each protein positioned at a point in the pH gradient corresponding to its pI .
上海交通大学医学院
[试剂]
Acr-Bis TEMED、AP Ampholine 电极缓冲液（5%H3PO4、2%NaOH）
上海交通大学医学院
[操作]
1.凝胶的制备 2.电泳 3.剥胶 4.观察结果
上海交通大学医学院
[结果]
pI HbA 6.87 HbF 6.98 HbA2 7.38
上海交通大学医学院
分辨率(resolution)较不连续PAGE更高， 特别适合于分离分子量(molecuar weight,MW) 相同而电荷(electric charge)不同的生物大 分子。
Q M = ——
6r
上海交通大学医学院
上海交通大学医学院
讲课内容
1
IEFE定义
2
IEFE的特点
3
IEFE的基本原理
4
IEFE的应用
5
血红蛋白的等电聚焦电泳（实验）
上海交通大学医学院
四、IEFE的应用 Applications of IEF
1.分析分离制备蛋白质、多肽 ①区分人血清蛋白 ②测出异常免疫球蛋白 ③基因分型 ④csf中寡克隆区带的检测 2.测定pI可鉴定蛋白质、多肽 3.双相电泳中，IEF作为第一相
干扰样品的测定。
上海交通大学医学院
2.载体两性电解质的合成
加成反应
丙烯酸+多乙烯多胺
Ampholine（LKB）
本质：一系列脂肪族(aliphatic ampholytes)多 氨基多羧酸同系物和异构体，具有很多既不相 同又十分接近相互连接的pI值。
pH范围：pH3~10
上海交通大学医学院
上海交通大学医学院
在电泳介质中放入载体两性电解质(carrier ampholytes) ，当通入直流电时，两性电解质形 成一个由正极(anode)到负极(cathode)逐渐增加 的pH梯度，正极附近是低pH区，负极附近是高pH 区。
上海交通大学医学院
蛋白质分子的电聚焦过程
+
+
pH=pI
-
—
a
b
a. 蛋白质分子在负极端 b. 蛋白质分子在正极端 c. 蛋白质样品中各组分聚焦成区带
讲课内容
1
IEFE定义
2
IEFE的特点
3
IEFE的基本原理
4
IEFE的应用
5
血红蛋白的等电聚焦电泳（实验）
上海交通大学医学院
三、IEFE的基本原理
上海交通大学医学院
蛋白质分子在不同pH下的解离状态
NH3+ P
COOH
pH＜pI pI
NH3+
NH2
P
P
COO-
COO-
pH＝pI
pH＞
上海交通大学医学院
上海交通大学医学院
上海交通大学医学院
进行IEFE必须具备3个条件：
①有一个在电泳条件下基本稳定、重复性良好的 pH梯度
②有一个抗对流的电泳材料，使已经分离的样品 不再重新混合
③电泳后有适当的方法来鉴定分离的区带
上海交通大学医学院
（一）pH梯度的建立
用多种两性电解质(ampholytes)混合物建 立稳定良好的pH梯度
上海交通大学医学院
当环境pH<pH’时，它带正电荷，朝负极移动， 直至移动到它的等电点处，在那里聚集。由于 两性电解质A在它的pI处具有一定的缓冲能力， 因此在它附近形成一个pH稳定区域。
上海交通大学医学院
同样载体两性电解质(carrier ampholytes) 中各种两性电解质也会各自迁移到它们的等电 点(isoelectric point,pI)处，由于它们的数 量足够多，各自的等电点相差很小，从而形成 一个pH梯度。
qqmm66rr上海交通大学医学院讲课内容iefe定义上海交通大学医学院上海交通大学医学院蛋白质分子在不同ph下的解离状态nhcoohcoophpiphpiphpi上海交通大学医学院在电泳介质中放入载体两性电解质carrierampholytes当通入直流电时两性电解质形成一个由正极anode到负极cathode逐渐增加的ph梯度正极附近是低ph区负极附近是高ph上海交通大学医学院蛋白质分子的电聚焦过程phpipi上海交通大学医学院在这个从正极到负极ph逐渐增加的直流电场中当蛋白质进入这个环境不同的蛋白质带上不同性质和数量的电荷向着一定方向移动迁移到与其相同的等电点位置上停留下来即被聚焦于一个狭的区带中得以分离
是在电泳介质中放入载体两性电解质(Carrier ampholyte)，当通以直流电时，两性电解质即
形成一个由阳极到阴极逐步增加的pH梯度，在 此体系中，不同的蛋白质即移动到或聚焦于其 相当的等电点位置上，也就是说被聚焦于一个 狭的区带中，电泳技术中的等电点聚焦也称为 聚焦电泳。
上海交通大学医学院
讲课内容
上海交通大学医学院
㈡引入电场时的变化
载体两性电解质 (carrier ampholytes)分子 将 向 阴 极 (cathode) 或 阳 极 (anode) 迁 移 ，带 有 最低 等 电点的分子（荷最多的负电） 将最快地向阳极迁移。当它 达到净电荷是零的位置时才 停止。
其次一些低pI的载体两 性电解质分子（荷其次多的 负电）也将向阳极移动，直 到它的净电荷被减少到零才 停止。
Isoelectric focusing (IEF), is a technique for separating different molecules by their electric charge differences.
上海交通大学医学院
等电聚焦(Isoelectric focusing ,IEF)就
上海交通大学医学院
[思考题]
1.PAGE与IEFE有何区别？ 2.本实验的关键步骤是什么？
上海交通大学医学院
参考书目
《蛋白质电泳实验技术》 科学出版社 郭尧君 《蛋白质技术手册》 科学出版社 汪家政 范敏 主编 《电泳》 科学出版社 何忠效 张树政 主编
上海交通大学医学院
3.pH梯度的形成
载体两性电解质(Carrier ampholytes)是 一系列不同分子的两性电解质的混合物,在通 电后，它们各自迁移到适当位置形成一个连续 的pH梯度(pH gradient)。
上海交通大学医学院
㈠没通电时的变化
所有的载体两性 电 解 质 (Carrier ampholytes) 分 子 都 荷 电，只是溶液中荷正 电和荷负电的基团数 目 相 等 ， 净 电 荷 (net charge)为零。
1
IEFE定义
2
IEFE的特点
3
IEFE的基本原理
4
IEFE的应用
5
血红蛋白的等电聚焦电泳（实验）
上海交通大学医学院
二、IEFE的特点
（一）优点
High Resolution High Sensitivity Good Reproduction
上海交通大学医学院
（二）缺点
1.要求用无盐溶液，而在无盐溶液中蛋白质可能 发生沉淀。
等电聚焦电泳
Isoelectric Focusing Electrophoresis，IEFE
李莉
http://www.shsmu.edu.cn/
讲课内容
1
IEFE定义
2
IEFE的特点
3
IEFE的基本原理
4
IEFE的应用
5
血红蛋白的等电聚焦电泳（实验）
上海交通大学医学院
一、IEFE 定义
IEFE一种利用具有pH梯度的支持介质分离 等电点（isoelectric point，pI)不同的蛋白 质的电泳技术。
上海交通大学医学院
1.理想的载体两性电解质（Carrier ampholytes） 应具备的特征：
①分子量要小，以便与被分离大分子物质分离； ②化学性质稳定； ③各成分的pI彼此接近，并在其pI值附近有良好
的缓冲能力； ④在pI处具有足够的电导，导电性均匀； ⑤两性电解质载体的数目要足够多； ⑥可溶性好； ⑦对280nm的紫外光没有或仅有很低的吸光度，不
Hb具有四条多肽链 （α、β、γ、δ）
上海交通大学医学院
HbA 正常成人血中主要的Hb成分。 HbA2 正常成人Hb中的一个次要成分，当
胎儿出生时，其浓度不到1%，以后 稍增多，在正常成人中其平均值自 2.2% 至2.6%左右，最高范围一般 不超过3.5%。
上海交通大学医学院wenku.baidu.com
HbF 1866年发现，是胎儿和初生儿的Hb的主要
上海交通大学医学院
㈢电泳结束后的变化 所有的载体两性电解
质(carrier ampholytes) 分子以增加pI级数的办法 将分别在阳、阴极之间到 达它们自己的位置而给出 一个pI梯度。
上海交通大学医学院
上海交通大学医学院
电解槽中，通电后，正负两极都会发生电极反应： 正极端反应：6H2O→O2+4H3O++4e负极端反应：4H2O+4e-→2H2+4OH-
上海交通大学医学院
上海交通大学医学院
上海交通大学医学院
（二）支持介质(medium)的选择 作用：防止扩散
抗对流 liquid medium：蔗糖、Ficoll gel medium：agarose、sephadex、PAG
上海交通大学医学院
（三）聚焦后的检测方法 各种染色法 扫描与定量 其它检测方法
上海交通大学医学院
双向电泳（two-dimensional electrophoresis, 2-DE）
上海交通大学医学院
考马斯亮蓝
银染
上海交通大学医学院
讲课内容
1
IEFE定义
2
IEFE的特点
3
IEFE的基本原理
4
IEFE的应用
5
血红蛋白的等电聚焦电泳（实验）
上海交通大学医学院
实验 血红蛋白的等电聚焦电泳
成分，足月的初生婴儿血中大约有70-80%为 HbF，其余为HbA。婴儿出生后不久，HbF的浓 度迅速减少，同时HbA相应增多，绝大多数正 常人于出生后6个月至2年后，HbF便降至成人 的正常浓度，以后HbF一直存在。
上海交通大学医学院
[器材]
电泳仪 凝胶玻管 三角烧杯 10cm长针头
在负极引起pH值的升高，在正极pH下降， 另外在电极槽的正极端放的是酸性溶液，负极 端放的是碱性溶液造成了在电极附近pH的急剧 变化
上海交通大学医学院
由于载体两性电解质(carrier ampholytes) 是一系列不同分子的两性电解质的混合物所组 成 的 ， 设 其 中 某 一 成 分 为 A， 它 的 pI=pH’， 当 环境中的pH>pH’时，它带负电荷，朝正极移动。
pI1 pI2 pI3 pIn
c
上海交通大学医学院
在这个从正极到负极pH逐渐增加的直流电 场中，当蛋白质进入这个环境，不同的蛋白质 带上不同性质和数量的电荷，向着一定方向移 动，迁移到与其相同的等电点位置上停留下来， 即被聚焦于一个狭的区带中 ，得以分离。
The proteins become focused into sharp stationary bands with each protein positioned at a point in the pH gradient corresponding to its pI .
上海交通大学医学院
[试剂]
Acr-Bis TEMED、AP Ampholine 电极缓冲液（5%H3PO4、2%NaOH）
上海交通大学医学院
[操作]
1.凝胶的制备 2.电泳 3.剥胶 4.观察结果
上海交通大学医学院
[结果]
pI HbA 6.87 HbF 6.98 HbA2 7.38