酒曲中产酒酵母菌的筛选及发酵能力的测定

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酒曲中产酒酵母菌的筛选及发酵能力的测定
一、实验目的
1.掌握酵母菌的筛选方法
2.复习用显微镜观察菌形态的操作步骤
3.掌握酵母生产性能的测定:酵母发酵力的测定、酵母产酒精能力的测定、及其乃酒精的能力、
4.学习酒精出酒率的计算
二、实验原理
酵母菌多数为腐生,一般生长在含糖较高,偏酸的环境中,在通气条件下,液体培养比霉菌快。

菌落于细菌相似,较大而厚,多数不透明,菌落光滑湿润粘稠,乳白色,少数干皱,边缘整齐,呈红色或粉红色,圆形、椭圆、卵形,液体培养基生长会生成沉淀或菌膜。

酒曲中含有细菌,霉菌,酵母菌等多种菌体,在菌体的分离提取中,通过对原菌的稀释,涂布,多次划线而使各种菌体得以分开,形成单菌落。

通过观察菌落的形态以及在显微镜下对单菌体形态特征的观察确定酵母菌个体。

三、实验材料
1.实验器材
恒温培养箱,高压灭菌锅,三角瓶,电炉,石棉网,水浴锅,移液管,移液管架,容量瓶,冷凝管,蒸馏烧瓶,铁架台,软管,天平,酒精计,超净工作台,试管,培养皿,接种环,玻璃棒,涂布棒,漏斗,滤纸,玻璃珠,纱布,脱脂棉,酒精灯,白瓷缸,分析天平,量筒,牛皮纸,报纸
2.试剂及药品
无水乙醇,蒸馏水,葡萄糖,磷酸二氢钾,硫酸铵,豆芽,琼脂,蛋白胨,酵母浸膏,硫酸镁,氯化钙。

3.实验材料:酒曲
4.种子培养基
豆芽汁培养基:
黄豆芽 100g;葡萄糖 50g;琼脂 20g;水 1000ml;PH 自然。

5.发酵培养基
A 酵母抽提物0.75 g,
B 蛋白胨0.75 g,
C 硫酸铵0.25 g,
D 磷酸二氢钾0.125 g,
E 硫酸镁0.09 g,
F 氯化钙0.07 g,
G 葡萄糖25 g,
H 蒸馏水250mL。

四、方法步骤
1、产酒酵母菌株的初选
(1)实验器材的准备与灭菌
1)清洗培养皿、锥形瓶数个,在干燥箱中干燥
2)检查并接通高压蒸汽灭菌锅,打开电源,在锅内加水,直至水位显示为高水位,设定温度为121℃,加热时间30min。

3)取出培养皿、锥形瓶,放置降温、用牛皮纸包裹放置在内锅层,加盖,并将盖上的螺栓以两两对称的方式同时旋转拧紧,防止漏气。

4)通电,在0.1Mpa,121℃,30min灭菌。

5)灭菌时间到后,切断电源,让灭菌锅内温度自然下降,当压力表的压力降至0时,打开排气阀,旋松螺旋,打开盖子,取出灭菌物品。

(2)培养基、无菌水的制备与灭菌
1)培养基的配方如下:
培养基成分
黄豆芽 100g
葡萄糖 50g
琼脂 20g
水 1000ml
PH 自然
2)配制方法
①称新鲜黄豆芽100g,置于烧杯中,再加入1000ml水,小火煮沸30min,用纱布过滤,补足失水,即制成10%豆芽汁。

②配制时,按每1000ml10%豆芽汁加入50g葡萄糖,煮沸后加入20g琼脂,继续加热融化,补足失水。

③分装、加塞、包扎,制备斜面试管。

④与包扎好的的无菌水一起高压蒸汽灭菌0.1MPa灭菌30min。

(3)倒平板:将灭菌好的培养基在无菌条件下倒入平板培养基,作为酵母菌的固体培养基备用。

(4)样品菌悬液制备
1、取样:用分析天平准确称取1g酒曲
2、制备悬液:取1g样品并用9ml无菌水溶解,振荡约20min,使样品与水充分混匀,将细胞分散。

用一支无菌吸管从中吸取1ml酒曲悬液加入装有9ml无菌水的试管中,吹吸3次,让菌液混合均匀,即成10-2稀释液;再换一支无菌吸管吸取10-2稀释液1 ml,移入装有9ml无菌水的试管中,也吹吸三次,即成l0-3稀释液;以此类推,连续稀释,制成10-1、10-2、10-
3、10-
4、10-5等一系列稀释菌液。

具体步骤可以参照下图土壤菌悬液稀释:
(5)平板涂布:用1mL移液管分别从各菌悬液试管中取菌悬液1mL于平板培养基上,用涂棒涂布均匀,每个稀释梯度做三个平板;
(6)培养:恒温培养箱28℃培养1-2天;
(7)观察细菌生长情况、结构状态和部落分布情况并记录,由于本次试验采用涂布平板法,无法准确知道酵母菌的含量。

(8)酵母形态的观察
从长出菌落的平板培养基上挑出酵母菌,用美蓝染色法取对数生长期的菌体进行制片,在放大10倍及40倍的显微镜下观察酵母形态,用测微尺测量酵母细胞的大小,并进行死活鉴别。

酵母菌是单细胞的真核生物,细胞核和细胞质有明显分化,个体比细菌大得多。

酵母菌的形态通常有球形、卵圆状、椭圆状、柱状或香肠状等多种形状。

酵母菌是通过芽殖进行繁殖,因此有时可以观察到带有芽的菌株。

酵母菌的菌落一般为乳白色的,湿润的圆滑菌落。

(9)酵母菌的分离纯化
采用划线法将确定为酵母菌的菌落挑出,并在无菌条件下用接种环连续划线到平板培养基上,然后恒温培养箱28℃培养1-2天。

(10)斜面接种,将划线培养基取出,从中挑取单菌落在无菌条件下接种到斜面培养基上,然后恒温培养箱28℃培养1-2天。

2、酵母菌的扩培
(1)制备种子液培养基
1)培养基的配方如下:
培养基成分
黄豆芽 100g;葡萄糖 50g;水1000ml; PH自然。

2)配制方法
①称新鲜黄豆芽100g,置于烧杯中,再加入1000ml水,小火煮沸30min,用纱布过滤,补足失水,即制成10%豆芽汁。

②配制时,按每1000ml10%豆芽汁加入50g葡萄糖,继续加热融化,补足失水。

③分装、加塞、包扎,分别装到三个三角瓶中,每个装100ml
④高压蒸汽灭菌0.1MPa灭菌30min。

(2)种子培养基接种
将灭菌好的种子培养基取出,待温度降至室温,分别从三根斜面培养基中接种环1~2环酵母菌到种子培养基中(注:无菌条件下),恒温培养箱30℃培养1天,即可使用。

3、酵母菌的发酵试验
(1)制备发酵培养基
发酵培养基:A 酵母抽提物0.75 g,B 蛋白胨0.75 g,C 硫酸铵
0.25 g,D 磷酸二氢钾0.125 g,E 硫酸镁0.09 g, F 氯化钙0.07 g,G 葡萄糖25 g,蒸馏水250mL。

PH自然。

配制1000mL发酵培养基
配置好后,冷却后分装到9个250ml锥形瓶中(每瓶装100ml)。

在121℃条件下高压灭菌30分钟。

(2)种子液扩大培养
将灭菌好,冷却的培养液取出,从种子培养基中取10ml种子液转移到发酵培养液中(无菌条件),每个种子液做三个发酵培养。

贴上标签,放入恒温培养箱30℃培养1~2天.
(3)酒精蒸馏与含量的测定:
4、比重计测定法测定产酒精能力:
(1).材料:①酒精比重计。

②100ml量筒。

③温度计。

(2)操作:①蒸馏:装好全套蒸馏装置,用容量瓶量取100ml发酵液,放入250ml的蒸馏瓶中,加50ml水。

迅速安装到冷凝管上进行蒸馏,并将此容量瓶用水洗净后,置冷凝管下端收集馏出液100ml,停止蒸馏,摇匀备用。

③测定:将酒精比重计慢慢放入酒精发酵液的蒸馏液中,手持温度计插在比重计杆旁,待温度稳定后,酒精停稳时读数,读数应以弯月面下缘为准,观察视线要与弯月面下缘相平。

④校正:根据所量的酒精度和温度、查表校正为28℃时酒精度。

0.6479-发酵糖转化为酒精的转化系数
五、实验结果与分析
1.实验测得的数据:
种子液A 种子液B 种子液C 发酵液一 2 3 3
发酵液二 2 3 3
发酵液三 3 3 3
发酵液温度28℃27℃28℃
2.换算成酒精浓度的数据:
种子液A 种子液B 种子液C 发酵液一 2.9 4.0 4.0
发酵液二 2.9 4.0 4.0
发酵液三 4.0 4.0 4.0
3.计算过的发酵率的数据:
不同酿酒酵母菌株的代谢过程有差异, 对可发酵性糖的利用程度不同,可能会导致最终的酒精生成率有较大差别。

各酿酒酵母菌株的发酵及产酒情况见上表。

由表可知,发酵48小时后,用蒸馏的方法测得的酒精含量整体偏低,可能是由于实验过程中污染杂菌,或者是操作不当使大量酿酒酵母菌体死亡,故在发酵时期所获得的酒精含量不高。

本试验通过从酒曲提取酿酒酵母,并分别对多株酿酒酵母的产酒精能力进行测定和比较, 初步筛选出生长较好的3株酵母菌。

通过酒精发酵试验表明, 2号、3号菌株的产酒精能力良好,但由于实验操作过程中的失误或酵母菌本身的原因,导致菌种的产酒精能力普遍偏低,也说明了其诱变后提高的空间很大。

分析以上结果可知, 酿酒酵母的2号菌的产酒精能力强,这为酵母菌的进一步诱变处理,得到更高的产酒精能力提供了理论依据。

可以对2号菌株进行诱变处理,进一步提高酵母的产酒精的能力。

六、实验感想
此次实验从最开始的查资料,确定方案,再到配制培养基,菌种的分离、纯化、培养、鉴定,以及后来的酒精蒸馏提取,测产酒精能力等过程中或多或少的遇到了一些问题,平常理论的时候,我们可以把它想象的很简单,但实践起来却处处是问题。

从这次实验中,我深切的体会到,查资料的重要性。

在实验前,要根据实际,通过查资料,确定最合理的实验方案。

此外,更加明白了动手才是硬道理,做实验要有自己的主见,要善于发现问题,发现问题后要学会分析问题,解决问题。

这次实验能顺利完成,要感谢肖连冬和程爽老师的关心指导,同时也要谢谢同组同学的相互讨论与帮助。

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