第七章 定点诱变

3. 重叠延伸PCR诱变法 Overlap extension
对于两个具有部分重叠序列的 DNA 片段，在 经过变性和复性后，两个 DNA 片段之间通过 同源序列形成部分杂合的双链，在 DNA 聚合 酶作用下，杂合双链可互为引物和模板，引 导 DNA 的合成，从而形成杂合 DNA 双链
该方法需要4个引物,
再用通用引物扩增诱变的全长的DNA
5’
3’
3’
5’
4. 重叠延伸剪接法
Splicing by overlap extension, SOE
可用于将两个 DNA 片段在所期望的位点进行连接。 核心:设计一对融合寡核苷酸引物
包括两个步骤：设计一个寡聚体引物，其序列包含两个 部分，“引发”和“重叠”部分，引发部分在 3’ 末端， 起引物作用；重叠部分在 5’ 末端。与待融合的 DNA 片 段序列互补。
（二）位点选择诱变 Altered Sites in vitro Mutagenesis System 使用了2个寡核苷酸引物 一个是用来引入突变的突变引物 一个是用来选择用的
选择性引物可用来恢复有缺陷的抗生素抗 性基因，同时可用来选择引入突变的DNA链
1.将目的片段克隆到载体 2.得到重组质粒 3.模板DNA碱变性，与突变引物、氨苄青霉素抗性 基因修复引物（amproligo）和四环素抗性基因敲除 引物（tetsoligo）同时退火 4.用T4 DNA聚合酶和T4 DNA连接酶合成突变链 5.转化大肠杆菌ES1301菌株（mutS），用氨苄青霉 素筛选 6.纯化质粒，转化大肠杆菌JM109，用氨苄青霉素 筛选 7.必要的话，影印一份平板，鉴定四环素敏感的克 隆子，从而获得突变体 8.再做一轮诱变，修复四环素抗性基因并敲除氨苄 青霉素抗性基因
利用BAL 31核酸酶制备嵌套缺失突变体
处理不同时间
Klenow DNA聚合酶 补平末端
与克隆载体连接
3．DNase Ⅰ 的消化
一种内切酶，可优先水解 ds or ss DNA 中的 嘧啶核苷酸 。 Mg2+ ：独立作用于每条 DNA 链，位点随机。
基因A P2
基因B
P1
5. 大引物PCR诱变法
大引物PCR法由Kammann M等人于1989 年提出,随后经Sarkar G和Sommer S S等人加 以改进。 该方法需2个侧翼引物和1个内部诱变引物, 经过2轮PCR获得突变的全长DNA。 第1轮PCR用诱变引物和1个侧翼引物,扩增 产物经凝胶纯化后作为大引物再与另一侧翼 引物进行第2轮PCR,产生全长的突变的DNA。
1. 核酸外切酶Ⅲ(ExonucleaseⅢ,ExoⅢ)的消化 原理：就是利用核酸外切酶 Ⅲ(ExonucleaseⅢ，ExoⅢ可特异性地切割线 型双链DNA分子3’凹端产生5’突出端这一性 质而进行的一种缺失反应。利用该技术可构 建一系列梯度缺失重组子
A
B C
2．BAL 31 的消化
主要活性：3’外切核酸酶活性，可从线性 DNA 两条链的 3’ 端去除单核苷酸。 还具有较弱的内切核酸酶活性可降解单链（单 链， nick, gap），依赖 Ca2+ ，EGTA 可抑制活 性。 两种活性结合产生平端或较短5’突出端的缩短 分子
三个步骤： 1. 突变寡核苷酸引物的合成：化学合成能与野 生型DNA模板的靶区域退火、并携带所需突 变的寡核苷酸，作为体外合成DNA的引物
2. 由DNA聚合酶根据模板序列延伸寡核苷酸， 产生含有预定突变的双链DNA
模板：ssDNA or dsDNA。DNA片段，诱变合 成后克隆到载体上；完整的质粒（＜9kb） 3. 测序。对突变体DNA进行测序，验证靶点的 突变，确保其它区域没有发生额外的突变
2）. 诱变的效率 提高诱变效率是以PCR为基础的定点诱变面 临的问题。 通过PCR条件的优化、不同Tm值的引物的 巧妙的设计、不对称扩增、把引物标记上生 物素分离突变DNA等手段可以提高诱变效率。 PCR定点诱变方法的不断创新和发展使得分 子生物学关于基因和蛋白质的结构与功能的 基础研究和基因工程中定点改造目的基因更 加简便、高效、低耗。
5.诱变寡核苷酸引物3’区域有10-15bp与模板链完全配 对，形成足够稳定的杂交分子，有效地从诱变寡核 苷酸引物3’端引发DNA的合成 6.无回文、 重复或自身互补序列，否则，形成二级结 构，与靶序列杂交率降低，导致得不到突变体
7. 必要时可在诱变寡核苷酸上加上新的酶切位点， 或消除靠近诱变点的已有酶切位点，便于诱变后通 过限制酶消化筛选侯选突变子
（四） PCR 介导的定点诱变
1. 同源重组法 在一般宿主内发生同源重组,但需高 转化效率
2. DpnⅠ法
以反向PCR为基础,直接以含有目的基因的环 状质粒为模板,用2个反向的、5′端相邻且磷酸 化的引物向2个反方向延伸,扩增出线性的双链 DNA,然后用DpnⅠ酶降解甲基化或半甲基化 (只含有1条模板链)的模板链,而在体外合成的 突变链不受DpnⅠ酶的降解,这样可以净化突 变的双链DNA。最后用连接酶连接形成带突 变基因的环状质粒
第三节
寡核苷酸介导的定点诱变 p176
基因的定点诱变（site-directed mutagenesis）: 使已克隆基因或DNA片段中的任何一个特定碱 基发生取代、插入或缺失突变的过程
需一个或多个含突变碱基的诱变寡核苷酸作为 引物进行DNA复制，使寡核苷酸引物成为新合 成的DNA子链的一部分
一、寡核苷苷酸引物的设计
设计原则： 1. 与靶DNA的适当链互补，与靶的其它区域不能错 误杂交 2. 足够的长度与靶序列特异结合，1-2个碱基改变的 引物要求至少25bp长 3. 错配碱基位于中央位置，使每侧有10-15bp与模板 链完全配对。有效引入多于3个核苷酸突变时，要 求引物在诱变点的每侧有30个核苷酸与模板互补 4. 5’端与模板完全互补，从上游引物起始的DNA合成 不会取代诱变寡核苷酸,DNA聚合酶的5’→3’外切核 酸酶活性是造成上游DNA合成取代5’核苷酸的原因
三、经典DNA定点诱变
70年代初 φ×174 DNA （ss DNA 5386bp），当用带琥珀突变的 ssDNA 与 变性的野生型DNA片段一起转染细菌时， 观察到“标记获救”现象。即产生带野生 型基因组的噬菌体，原因是野生型 DNA 片段与突变体的相应序列退火，形成错配 的异源双链体，后者可被宿主编码的错配 修复系统转变为全长的野生型基因组。由 此可利用突变的 DNA 片段将突变引入到 野生型 DNA 中。
单 管 大 引 物 PCR 诱 变
6.以PCR为基础的定点诱变技术存在的问题 及解决对策 1）.诱变产物的忠实性 PCR产物有相对高的错误率,除目的突变外,常 包含一些非预定突变。可以通过以下2个方法 将错误率降到最低。 ①限制扩增的循环数 ②应用更好的热稳定DNA聚合酶,如Pfu,Vent等, 它们具有3’→5’外切酶活性,并具有校正功能
制备单链DNA模板时用ung- dut-突变的大肠 杆菌菌株如CJ236菌株，该菌株合成的 DNA中部分胸腺嘧啶被尿嘧啶取代。如 M13噬菌体DNA中有20-30个尿嘧啶
2．原理 Kunkel 法过程包括： ① 目标 DNA 插入 phagemid 载体并进入 E.coli CJ236 。
② 由于该菌体 ung- dut- 突变，合成的 DNA 上含有少量尿嘧啶（取代胸腺嘧啶）
第四节 嵌套缺失 嵌套缺失(Nested Deletions)的制备主要依赖核 酸酶,如核酸外切酶Ⅲ (ExonucleaseⅢ,ExoⅢ),BAL31或DNaseⅠ,这些 酶可以特定的作用方式消化DNA,同时消化 DNA的速率可控制,因此能同时分离嵌套缺失 和多组终末端相差无几的缺失体 利用该技术可构建一系列梯度缺失重组子,借此 可对该段DNA分子上的重要功能区进行定位, 用于寻找在基因表达调控中起关键作用的启动 子和增强子等顺式作用元件
第七章 DNA定点诱变
Site-directed mutagenesis of cloned DNA
突变是研究基因结构与功能的最基本的手段 经典的方法：分离自发突变体 用物理、化学诱变剂处理活体 诱变-整个生物体-目的基因上的突变极其有限 体外诱变(in vitro mutagenesis)：对克隆化的 DNA进行诱变处理可得到经典诱变所能得到 的所有种类的突变
突变方式:
定点诱变
随机诱变
•易错PCR(error-prone PCR)
•DNA重排(DNA shuffling)
•体外随机引发重组(random-priming in vitro recombination) •交错延伸(staggered extension process,StEP)
突变类型: 单个碱基的置换 简单的插入或缺失 系统的缺失、插入或成串碱基的置换
Picard V,1994和Song-Hua Ke,1997等分别建立了单管 大引物PCR(Single-tube megaprimer PCR)。单管大引 物法省去第1轮PCR产物的纯化过程,实现在同一管 中先后进行两轮PCR反应。Song-Hua Ke提出的方案 更加巧妙简单。 需设计Tm值不同的2个侧翼引物,第1轮PCR反应用 低Tm值的侧翼引物(F1)和诱变引物,用较低的退火温 度,扩增反应产生大引物。然后再加入高Tm值的侧 翼引物(F2)在较高的退火温度下进行第2轮的反应, 扩增出全长的含突变位点的DNA产物。
③ M13K07 辅助感染下，产生带 U 的单链 DNA 。 ④ 与引入诱变的 Oligo 复性。
⑤ 在 T7DNA polymerase 和 ligase 作用下， 以带 U 的单链 DNA 为模板合成一条新链， 形成杂合双链。 ⑥ 感染 dut+ ung+ E.coli MV1190 后，在 细胞分裂过程中，只有新合成的 DNA 链才 能起模板作用合成新的并引入了诱变位点的 子代双链 DNA 。而有 U 的 DNA 链，在 dut+ 和 ung+ 产物的作用下，尿嘧啶被水解，从而 失去作为模板的能力。
包括2个含有突变碱基的反向互补的引物,2个上、 下游通用引物。
整个诱变过程需要3个PCR反应分2轮进行。
第1轮PCR的2个反应分别产生2个含突变位点的
上下游DNA片段,这2个DNA片段的末端互补。第1 轮PCR的产物需要经凝胶电泳纯化。
第2轮PCR将上述2个PCR产物混合,通过末端互补
配对互为引物延伸得到完整的含突变位点的全长 DNA
设计另一个引物，该引物与上一个引物完全互补。
下图为将某基因的启动子与另一基因的编码序列连接示 意图
基因A
基因B
基因B:引物的5’端部分为基因A的ATG密码 子上游紧邻的序列,3’端则为基因B从ATG 密码子开始的序列 基因A:基因B的融合引物与基因A的融合引 物完全互补 这两个融合引物各自与侧翼引物扩增的产 物有完全同源的序列,可以进行重叠延伸
位点选择诱变原理图
（三）转化子诱变 Transformer Site-Directed mutagenesis
使用了2个寡核苷酸引物 一个是用来引入突变的突变引物 一个是用来剔除单一酶切位点的 将待突变的DNA片段装载到克隆载体上，该载体上 必须存在单一酶切位点。当这两个引物同时指导 DNA合成时，突变的DNA链将不再含有单一酶切 位点，而模板DNA在该位置能被切割。通过转化大 肠杆菌，线性化的DNA不能复制，只有突变链保持 环状，可以获得转化子
(一)、Kunkel法或称 “U” 法 1．背景介绍 dut-：dUTP 酶缺陷，细胞不能把 dUTP 转 化为 dUMP ，因此细胞内 dUTP 的含量大 为增加，其中一些 dUTP 可掺入 DNA 中正 常情况下由胸腺嘧啶占据的位置。 ung-：UDG 酶缺陷， UDG 酶[尿嘧啶 （uracil）-N-糖基化酶（glycosylase）]可除 去掺入 DNA 中的尿嘧啶残基,产生脱碱基 的位点。含有脱碱基的DNA链不再具备作 为完整复制模板的能力