基因题库及参考答案

转基因植株中外源基因的转录水平可以通过细胞总 RNA 或 mRNA 与 DNA 探针的 杂交来分析，称 Northern 杂交。它是 RNA-DNA 异质双链杂交。 步骤同 Southern 杂交法（mRNA 水平） 。 外源基因表达蛋白的检测 外源基因编码蛋白在转基因植物中能够正常表达并表现出应有的功能是植物 基因转化的最终目的。 表达蛋白应具有一定的稳定性，不被细胞内的蛋白酶迅速 降解，同时应对植物细胞无毒性。 外源基因表达蛋白检测主要利用免疫学原理，ELISA 及 Western 杂交是经典 的方法。 Western 杂交是将外源基因转录并翻译的蛋白质从 SDS 聚丙烯酰胺凝胶中转 移至固相支持体上， 然后对固定化蛋白质进行免疫学测定， 是根据蛋白质 （抗原） 可以和该蛋白质的特异抗体相结合的原理而进行的。蛋白质区带-----抗体（同 位素标记） ；蛋白质水平 生物学鉴定 表型鉴定；稳定性鉴定；最终鉴定；抗病；抗虫；抗除草剂；花色改变； 品质改良 4、试述作为克隆载体的 DNA 分子必须具备的条件。 （1）具有复制起点 （2）具有抗菌素抗性基因 （3）具有若干限制酶单一识别位点 （4）具有较小的相对分子质量和较高的拷贝数。 5、细菌质粒的一般生物学特性? 1）很多细菌中已发现； 2） 是独立于细菌染色体之外的辅助性遗传单位，基因组绝大部分为双链环状 DNA，不同质粒大小各异； 3）大多数质粒的宿主范围较窄； 4） 已发展进化出多种机制以维持其在细菌宿主中的稳定的拷贝数；在不同的 宿主细胞中拷贝数可能不同。 5）复制转录的进行依赖于宿主编码的酶和蛋白质； 6）常含有一些编码对细菌宿主有利的酶的基因。 6、什么是限制性内切核酸酶的星号活性? 受哪些因素影响? 在非理想的条件下，内切酶切割与识别位点相似但不完全相同的序列，识别 专一性下降，这一现象称星号活性。 影响因素：甘油浓度过高 离子强度不合适 阳离子变化 pH 变化 有机溶剂残留 7、切口移位(nick translation)标记探针的主要步骤有哪些?
基因工程复习题
一、名词解释 1、PCR：多聚酶链式反应：是体外酶促合成特异 DNA 片段的一种方法,由高温变 性、低温退火（复性）及适温延伸等几步反应组成一个周期,循环进行, 使目的 DNA 得以迅速扩增。 2、分子克隆工具酶：基因工程技术中能用于 DNA 和 RNA 的合成、切割、连接和 修饰的各种酶。 3、 基因沉默： 基因沉默是指转基因植物和转基因动物中往往会遇到这样的情况， 外源基因存在于生物体内，并未丢失或损伤，但该基因不表达或表 达量极低的现象。基因沉默是真核生物细胞基因表达调节的一种重 要手段。 在染色体水平，基因沉默实际上是形成异染色质的过程， 被沉寂的基因区段呈高浓缩 状态。 4、限制性核酸内切酶：识别 DNA 的特异序列，并在合适的反应条件下使每条链 一定位点上的磷酸二酯键断开，产生具有 3’—OH 基团 和 5’磷酸基团的 DNA 片段的内切脱氧核糖核酸酶。 5、受体细胞：受体细胞也叫宿主细胞。在病毒获得宿主后，利用宿主的蛋白质 和其他物质制造自己的身体，然后将遗传物质注入到细胞内部感 染细胞。受体细胞有原核受体细胞(最主要是大肠杆菌)、真核受 体细胞(最主要是酵母菌)、 动物细胞和昆虫细胞(其实也是真核受 体细胞)。 6、穿梭质粒载体：是一类由人工构建的具有两种不同复制起点和选择记号，因 而可在两种不同的寄主细胞中存活和复制的质粒载体。 7、脉冲电场电泳法：DNA 分子在交替变换方向的电场中作出反应所需的时间取 决于它的大小，在两个不同方向的电场周期性交替进行的 这种电泳叫脉冲电场电泳法。 8、报告基因：指其编码产物能够被快速的测定，常用来判断外源基因是否已经 成功地导入寄主细胞（器官或组织）并检测其表达活性的一类特 殊用途的基因。 9、探针：一段带有检测标记的与目的基因或目的 DNA 特异互补的已知核苷酸序 列。 10、转基因生物：用基因工程技术导入外源基因的动植物，且外源基因能通过繁 殖而传代。 11、选择标记基因：简称选择基因，是指可使被转化的细胞获得其亲本细胞所不 具备的遗传特性， 从而使得人们能够使用特定的选择培养基， 将转化的新细胞从亲本细胞群体中选择出来的一类特殊的基 因。 12、核酸分子杂交：把同源关系较近的，不同生物个体来源的变性 DNA 或 RNA 单链， 经退火处理形成 DNA-DNA 或 DNA-RNA 这一过程叫分子 杂交。 13、同裂酶：来源不同，但是具有相同的识别序列。 14、 同尾酶： 不同来源的限制性核酸内切酶识别与切割的核苷酸靶序列也各不相
gc含量以4060为宜太少扩增效果不佳gc过多易出现非特异条带atgc最好随机分布避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列避免引物内部出现二级结构避免两条引物间互补特别是3端的互补否则会形成引物二聚体产生非特异性的扩增条带引物3端的碱基要求严格配对特别是最末及倒数第二个碱基以避免因末端碱基不配对而导致pcr失败引物中有或能加上合适的酶切位点被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点这对酶切分析或分子克隆很有好处引物的特异性
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1）将 DNAase I 的水解活性与大肠杆菌 DNA 聚合酶 I 的 5`→3`的聚合酶活 性和 5` →3`的外切酶活性相结合。 2）首先用 DNAase I 在探针 DNA 双链上造成缺口，然后再借助于 E.coli 的 DNA pol I 的 5`→3`外切酶活性，切去带有 5`-磷酸的核苷酸；同时利用 该酶 5`→3`聚合酶活性，以互补的 DNA 单链为模板，使生物素或同位素 标记的互补核苷酸补入缺口的 3末端-OH 上。 3）这两种活性同时作用，缺口不断向 3`方向移动，DNA 链上的核苷酸不断为 标记的核苷酸取代，成为带有标记的 DNA，纯化除去游离脱氧核苷酸后成 为标记 DNA 探针。 8、植物基因转化系统的选择原则? 1）高效稳定的再生能力； 2）受体材料要有较高的遗传稳定性； 3）外植体来源方便，如胚和其它器官等； 4）对筛选剂敏感； 5）转化率高
9、 限制性内切酶的识别特点： 1）大多数识别序列是很严格的，只有少数有变动的余地。如: EcoRⅠ GAATTC , 而 Hind Ⅱ GTPyPuAC 2）识别序列的碱基数一般为 4—6 个碱基对。 3）大多数识别位点具有 180 度旋转对称性，即回文结构(Palindromic)。
10、影响限制性核酸内切酶反应效率的因素 1. 温度：一般 37°C，有例外,如：BamHⅠ 30°C， Sma I 25°C，TaqⅠ 65°C； 2. 缓冲液：高、中、低盐之分 (NaCl)，pH 值； 3. 时间：1-1.5 小时 4. 反应体积和甘油浓度：酶<1/10 体积 5. DNA 纯度与构型 （1）纯度：RNA，蛋白，氯仿，SDS，EDTA， EB，酚，乙醇，硫酸根，DNA （2）构型：切超螺旋需更多的酶 例: lmg l DNA, 用 EcoRI 切, 1U 超螺旋 pUCl9, EcoRI 2.5U 11、 Klenow 酶的基本性质及用途。 （1）Klenow 酶的基本性质： 大肠杆菌 DNA 聚合酶 I 经枯草杆菌蛋白酶处理,获得 N 端三分之二的大肽 段,即 Klenow 酶。 Klenow 酶仍拥有 5`→3`的 DNA 聚合酶活性和 3`→5`的核酸外切酶活性， 但失去了 5`→ 3`的核酸外切酶活性。
④避免引物内部出现二级结构 避免两条引物间互补， 特别是 3’端的互补，否则会形成引物二聚体，产生 非特异性的扩增条带 ⑤引物 3’端的碱基要求严格配对 特别是最末及倒数第二个碱基，以避免因末端碱基不配对而导致 PCR 失败 ⑥引物中有或能加上合适的酶切位点 被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点，这对酶切分析或分子克隆很有好处 ⑦引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性 ⑧引物量： 每条引物的浓度 0.1 ~ 1umol 或 10 ~ 100 pmol，以最低引物量产生所需要的 结果为好 引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增， 且可增加引物之间形成二聚体的机 会。 3、用哪些方法可以检测转基因植物中的外源基因？ 答：方法有报告基因的表达检测、转基因植物的 PCR 检测、外源基因整合 的 Southern 杂交鉴、外源基因转录的 Northern 杂交检测、外源基因 表达蛋白的检测、生物学鉴定 注： 报告基因的表达检测 转基因植物的 PCR 检测 PCR 是在体外快速特异地扩增目的基因 DNA 片段的有 效方法。能在几小时内使 pg 水平的起始物达到 ng 水平,扩增产物经琼脂糖凝胶 电泳,溴化乙锭染色后很容易观察 ,不通过杂交分析就可以鉴定出基因组中的一 些顺序。这项技术可用于转化后外源基因的鉴定和植物基因组的分析 但由于 PCR 扩增十分灵敏， 有时会出现假阳性扩增，因而对外源基因是否整合需 要进行扩增产物的 Southern 杂交。 转基因植物的 PCR 检测 PCR 是在体外快速特异地扩增目的基因 DNA 片段的有效方法。能在几小时内 使 pg 水平的起始物达到 ng 水平,扩增产物经琼脂糖凝胶电泳,溴化乙锭染色后很 容易观察,不通过杂交分析就可以鉴定出基因组中的一些顺序。这项技术可用于 转化后外源基因的鉴定和植物基因组的分析 但由于 PCR 扩增十分灵敏，有时会出现假阳性扩增，因而对外源基因是否整 合需要进行扩增产物的 Southern 杂交。 外源基因整合的 Southern 杂交鉴 原理：利用两条单链 DNA 的碱基互补性，来检测外源 DNA 的转化结果；DNA 水平 Southern 杂交法的步骤：提取转基因植物的 DNA；限制性内切酶消化；琼 脂糖凝胶电泳；碱性溶液中使 DNA 解离成单链；转膜---凝胶上的 DNA 区带按原 位吸印到膜上；与探针杂交；洗膜；显影 外源基因转录的 Northern 杂交检测 通过 Southern 杂交可以得知外源基因是否整合到植物染色体上。但是，整合 到染色体上的外源基因并不一定表达。
同，但都产生相同的粘性末端，这类酶称为同尾酶。 15、星号反应：在非理想的条件下，内切酶切割与识别位点相似但不完全相同的 序列，识别专一性下降，这一现象称星号活性（Star Activity） 。 16、质粒：存在于细胞中，独立于染色体外，具有自主复制能力的遗传单位，共 价闭合环状的超螺旋双链 DNA 分子。 17、克隆载体：使目的片段能在细菌细胞中复制的载体。 18、表达载体：使目的基因能在细菌细胞表达为 RNA 或蛋白质的载体。 19、 cosmid 克隆载体：人工构建的含有λ DNA 的 cos 位点序列和质粒复制子的特 殊类型的质粒载体。 20、荧光定量 PCR：通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针,对 PCR 产物进行 标记跟踪,实时在线监控反应过程,结合相应的软件可以对 结果进行分析,计算待测样品的初始模板量。 21、转基因技术：用人工分离和修饰过的外源基因通过载体、媒体或其他物理、 化学方法导入植物细胞中并得到整合和表达， 并通过对转化植 株的鉴定选择，从而使其遗传性状发生改变的技术，创造出人 类所需要的新品种或新物种。 22、转基因食品：利用现代分子生物技术，将某些生物的基因转移到其他物种中 去，改造生物的遗传物质，使其在形状、营养品质、消费品质 等方面向人们所需要的目标转变。 23、DNA 变性：在物理或化学因素的作用下，导致两条 DNA 链之间的氢键断裂， 而核酸分子中的所有共价键则不受影响。 24、DNA 复性：当促使变性的因素解除后，两条 DNA 链又可以通过碱基互补配对 结合形成 DNA 双螺旋结构。 25、退火：指将温度降至引物的 TM 值左右或以下，引物与 DNA 摸板互补区域结 合形成杂交链。 26、质粒不亲和性：在没有选择压力的情况下，两种不同质粒不能够在同一宿主 细胞系中稳定地共存的现象。 27、转化：指质粒 DNA 或以它为载体构建的重组 DNA 导入细菌的过程。 二、简答题 1、何谓基因沉默，它的作用机制有哪些？ 基因沉默是指转基因植物和转基因动物中往往会遇到这样的情况，外源基因 存在于生物体内，并未丢失或损伤，但该基因不表达或表达量极低的现象。 机制： ①位置效应 ②DNA 甲基化 ③重复序列诱发 ④共抑制 （书 P99—100） 2、设计 PCR 的引物应遵守哪些原则？ ①引物长度： 15-30bp，常用为 20mer 左右 引物的有效长度不能大于 38 mer，否则最适延伸温度会超过 TaqDNA 聚合酶的 最适温度（74℃） ，不能保证 PCR 扩增产物的特异性 ②引物扩增跨度：以 500bp 为宜 特定条件下可扩增长至 10kb 的片段 ③引物碱基：G+C 含量以 40-60%为宜 G+C 太少扩增效果不佳，G+C 过多易出现非特异条带 ATGC 最好随机分布，避免 5 个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列