保护剂在微生物真空冷冻干燥中的应用_牛晓影

Application of protectants in freeze－ dried microorganism
2， * NIU Xiao－ ying1 ， DENG Li－ li1 ， ZENG Kai－ fang1 ，
( 1.College of Food Science， Southwest University， Chongqing 400715 ， China; boratory of Quality ＆ Safety Ｒisk Assessment for Agro－products on Storage and Preservation( Chongqing) Ministry of Agriculture， Chongqing 400715 ， China) Abstract: The lower viability of freeze－ dried microorganism restricts the development and application of fruits and vegetables biocontrol agents， probiotics and starter cultures in some extent ， but adding the appropriate protectants can compensate such deficiency widely. This paper summarized the application of protectants in lyophilization， and classifies the protectants from different angles， such as chemical structure， source， permeability， protective phase， and selects some common protectants， such as skimmed milk powder， trehalose， sodium glutamate， to illustrate their protective mechanism and applications. Besides， the paper introduced symergistic methods of protectants to show that using only one protectant during freeze － drying can not achieve ideal viability and the synergism of different protectants will make the commercialization of biocontrol agents and starter cultures possible. Key words: freeze－ drying ; protectant; protective mechanism; synergistic methods 中图分类号：TS201.1 文献标识码：A doi：10． 13386 / j． issn1002 － 0306． 2015． 01． 074 文 章 编 号：1002－0306 （ 2015 ） 01－0390－06
及应用， 而保护剂的加入可以较大幅度的弥补这一劣势。本文综述了保护剂在微生物真空 冷 冻 干 燥 中的 应 用 状 况， 将 目前使用的保护剂按照化学结构、 来源、 穿透能力、 保护阶段 等 不同 方 法 进 行 了 分 类; 对 常 用的 几 种 保 护 剂 脱 脂 奶 粉、 海藻糖以及谷氨酸钠的保护机理及应用进行了介绍; 并阐述了保护剂的增效途径， 微生物冷 冻 干 燥 使 用 单 一 保 护 剂 不 足以得到理想的存活率， 只有在合适的条件下对保护剂进行复配增效才能够使生防试剂、 发 酵 剂等 的商 业 化 应 用成 为 可能。 关键词：真空冷冻干燥， 保护剂， 保护机理， 增效途径
团泛菌（ Pantoea agglomerans ） 进行研究， 得出最佳的 5g /100mL 保护剂是海藻糖和蔗糖， 当使用 的海藻糖 时， 其存活率达到 83% 左右， 当使用 10g /100mL 的蔗
［14 ］ 糖时， 存活率达到 75% 左右 。 糖类保护性能的不

同源于它们与水结合能力和抑制细胞内外冰晶形成 ［15 ］ ［16 ］ 与是否能够参与代谢没有多大关系 。 的差异 ， 有研究表明二糖比三糖应用广泛是因为二糖比三糖 对磷脂膜有更强的结合力
1.2
按保护剂的来源进行分类
按保护剂的来源可将保护剂分为： 内源性保护 剂、 外源性保护剂。 前者是指微生物本身存在的或 培养条件、 周围环境改变使其自身合成的具有保护 性的物质， 后者是指冷冻前另加入菌悬液中以保护 为目的的物质。此种分类研究方法主要针对的是海 藻糖。有研究表明在冷冻干燥过程中， 只有细胞膜 两侧都存在海藻糖才能有效的保护酵母菌 菌有特殊的海藻糖载体
。另一方面有研究表明， 真空冷冻干燥后微生
物存活率下降的最主要原因是冷冻干燥过程中冰晶 的形成、 高浓度胞内溶质引起的高渗透压导致微生 物细胞膜破坏， 此外脱水影响了亲水性大分子性能， 蛋白质降解等最终影响了微生物的存活率
［7 ］
。
干燥、 贮藏等外部环境对微生物存活 针对冷冻、 率造成的影响， 可在菌悬液中加入合适的保护剂， 减 少或避免外部恶劣环境条件对微生物造成破坏， 进 而提高微生物的存活率， 为其商业化应用提供可能 。
［30 ］ 存活率达到 28% 左右 。常见的氨基酸保护剂有谷 氨酸、 天冬氨酸、 脯氨酸、 半胱氨酸等。 有荧光探针 ［28 ］
。0.1 ～4g /100mL 的血
清白蛋白很长时间被作为病毒和立克次体的冻干保 2g /100mL 的类人胶原蛋白可 。有研究表明， 使长双歧 杆 菌 （ Bifidobacterium longum ） 存 活 率 达 到 39.09% ± 1.27% ［19］ 。 Wang 等以发酵豆奶作为保 护 剂可使 长 双 歧 杆 菌 （ B. longum B6 ） 的 存 活 率 达 到 43% ～52% ［20］ 。
［17 ］
。
血清、 大豆蛋 蛋白类保护剂主要包括牛乳蛋白 、 白、 胶原蛋白等， 有研究表明蛋白质比糖类有更高的 玻璃化转变温度， 在冷冻干燥形成玻璃态方面， 蛋白 ［1 ］ 质比糖类扮演更重要的角色 ， 此外蛋白质可在微生 物细胞壁外形成保护性外膜 护剂
［18 ］ ［9 ］
， 但也有
研究得出乳酸菌在中性环境的存活率要高于酸性环 境的存活率， 甘油有助于克服酸性环境给乳酸菌带 来的不良影响 。 南君勇等研究表明 5% 的甘油可 以使热带假丝酵母（ Candida tropical ） 的存活率达到 28% 左右［29］ 。 此 类 保 护 剂 可 以 在 冷 冻 时 形 成 玻 璃 态， 抑制冰晶的形成， 防止高渗透压引起的盐类毒性 对细胞膜造成破坏。 能够穿透细胞壁而无法穿透细胞膜的保护剂主 要有氨基酸、 分子量较小的聚合物例如 PEG － 1000 。 此类保护 剂 可 以 在 细 胞 膜 和 细 胞 壁 之 间 形 成 缓 冲 层， 抑 制 冰 晶 的 形 成， 保 护 细 胞 膜。 有 研 究 表 明 1g /100mL的 PEG 可以使热带假丝酵母（ C. tropical） 的
在食品领域， 微生物真空冷冻干燥技术主要应 用在采后 果 蔬 生 防 试 剂 、 益 生 菌、 发酵剂等的研究 上， 与其他保种技术相比， 真空冷冻干燥技术可使菌 ［1 ］ 悬液形成干粉方便运输 、 销售及使用 ， 且形成干粉 后微生物的生化反应降到最低可使贮藏期内干粉的 ［2 ］ 生物、 化学、 物理性能保持相对稳定 ， 再者冻干粉使 用真空包 装 技 术 可 使 微 生 物 免 受 贮 藏 过 程 中 的 污 ［3 ］ 染 。然而真空冷冻干燥的微生物在经历了冷冻 、 干 燥、 贮藏三个阶段后， 它的存活率受到严重影响， 这 也是目前限制真空冷冻干燥微生物商业化应用最重
按保护剂的穿透能力可将保护剂分为三类： 能 够穿透细胞壁和细胞膜的保护剂 、 能够穿透细胞壁 而无法穿透细胞膜的保护剂、 既不能穿透细胞壁又 不能穿透细胞膜的保护剂。 穿透能力的不同反过来 会影响它们对微生物的保护机制， 保护作用大致可 ［18 ］ 分为细胞内保护和细胞外保护 。 此种分类方法最 初是用来分类冷冻保护剂的 。 能够穿透细胞壁和细胞膜的保护剂主要有二甲 基亚砜、 甘油等。二甲基亚砜和甘油是常见的冷冻保 护剂， 在微生物冷冻保种中发挥着重要作用。二甲基 亚砜对一些生物系统具有毒性作用， 毒性因微生物类 别而异， 在使用时， 应该避免二甲基亚砜的浓度超过 15% ， 且需要在解冻后对悬浮液进行离心或稀释。Tan 5g /100mL 的葡聚糖 + 7g /100mL 的海藻 等研究表明， 糖 + 1% 的 二 甲 基 亚 砜 可 以 使 多 孢 节 丛 孢 （ Arthrobotrys superba ） 的存活率达到 35% 左右［17］ 。对 于加有甘油的悬浮液很大程度上会延长干燥时间， 若干燥不完全， 甘油对冻干菌有负面作用
保护剂在微生物真空冷冻干燥中的应用
1 1 1， 2， * 牛晓影 ， 邓丽莉 ， 曾凯芳 ( 1. 西南大学食品科学学院， 重庆 400715 ; 2. 农业部农产品贮藏保鲜质量安全风险评估实验室( 重庆) ， 重庆 400715 )
摘
益 生 菌、 发 酵 剂等 的 开 发 要：真空冷冻干燥后微生物较低的存活率在一定程度 上限 制 了 诸 如 采 后 果 蔬 生 防 试 剂、
［27 ］
。
二糖、 三糖。 单糖中 糖类保护剂主要包括单糖、 最常用的保护剂有： 葡萄糖、 果糖、 半乳糖。 二糖中 最常用的保护剂有： 海藻糖、 蔗糖、 乳糖。 三糖中最 常用的保护剂是棉籽糖。 有研究表明单糖中半乳糖 保护效果最好， 三糖中棉籽糖对细菌的保护作用较 好
［9－10 ］ ［11－13 ］ ， ， Costa 等对成 二糖的保护效果普遍较好
［22 ］ ［21 ］
检测到当菌悬液中加入谷氨酸或天冬氨酸会使细胞 磷脂膜变得无序， 促使细胞膜流动性增强， 干燥后存 ［31 ］ Yang 等研究表明 0.1g /100mL 的 L － 半 活率上升 ， 胱氨酸可以使长双歧杆菌（ B. longum ） 的存活率达到 25.54% ± 0.52% ［19］ ， 脯氨酸 也有研究表明天冬氨酸、 对乳酸菌没有保护作用
要的原因。 事实上， 影响微生物真空冷冻干燥后存活率的 原因主要有两方面， 一方面是微生物自身， 另一方面 是冷冻、 干燥、 贮藏微生物的环境条件。 其中对微生 物自身来说， 它的培养条件、 微生物收获期、 冷冻干 燥前微生 物 的 浓 度 均 会 影 响 冻 干 后 微 生 物 的 存 活 率
［4－6 ］
收稿日期：2014－05－28 作者简介：牛晓影( 1990－ ) ， 研究方向: 食品生物技术。 女， 硕士研究生， * 通讯作者：曾 凯 芳 ( 1972 － ) ， 教授， 研究 方向: 农产 品加 工 女， 博士， 与贮藏工程。 基金项目: 国家自然科学基金项目( 31271958 ) ; 重庆市科技攻关( 应 用 技术研发 类 / 重 点 ) 项 目 ( cstc2012gg－ yyjsB80003 ) ; 教 育 部 留学回国人员科研启动经费( 45 批) 。
1
1.1
保护剂的几种分类方法
按保护剂的化学结构进行分类
390
按保护 剂 的 化 学 结 构 大 体 可 将 保 护 剂 分 为 三 类： 糖类保护剂、 蛋白类保护剂、 其他。 糖类和蛋白 质是相关研究中应用最广泛的两类保护剂， 是研究 人员选择保护剂首要考虑的对象
［8 ］
1.3
按保护剂的穿透能力进行分类