毒物分析基础法医毒物分析

原理
• 当被分析物在萃取头与萃取体系之间达到平 衡，分析物与萃取头之间有一分配系数K， 吸附于萃取头上分析物的量（N）与萃取体 系中分析物的初始浓度（C0）、萃取头体积 Vf 有如下关系： N=KVf C0
• 其中K值取决于萃取头一定的固定相类型、 分析物的性质，Vf 为常数，因此N与C0之间 存在线性关系。这是SPME的定量基础。
（二）柱切换技术
۞历史：snyder，1970年提出并使用
۞适用仪器：高效液相色谱 气相色谱 ۞原理：色谱柱一般分为预处理柱（也称富集柱）
和分析柱。通过阀件实现柱的切换，使样 品先在预柱上进行痕量富集，并除去大量 杂质，然后进入分析柱进行分离分析。 ۞优点：在线处理样本、速度快、操作简单
第三节 定性与定量
二、检材分离净化
（一）目的：纯化 （二）基本原理
1、利用形态分离 适于某些体外检材，采取分拣法。
2、根据理化性质分离
方 式
1）
利用比重不同
2）
分子或颗粒大小差异
离心、分液器
过滤、离心、超滤膜、 透析膜、分子筛、大 孔树脂等
3）
挥发性能不同
4）
溶解性能差异
5）
化学性质不同
6）
分子被吸附性能差异
水蒸汽蒸馏、解热 挥发等 沉淀、液液萃取或直 接萃取
定量分析的前提是必须先要明确和肯定是何种药 毒物，也就是先定性分析，然后才进行定量分析。 并非所有的毒物分析都需含量测定。一般为了必须 验证是否为正常人体组分或药物是否超剂量、以及 用含量来区分事件的性质、当事人法律责任等时， 才根据需要进行定量分析。
常用计量单位：
%； mg/100mL、mg/g、μg/g、ng/g、pg/g； mg/mL、μg/mL、ng/mL、pg/mL等。
浓缩-定容
1.预处理
（1）
固体:粉末 组织:匀浆
（2）
碱性毒物： pH>pKa 1-2；
酸性毒物: pH<pKa 1-2；
不稳定化合物: 缓冲液
（3）
加入蛋白 质沉淀剂 或者加热， 透析，超 滤
（4）
酸水解 酶水解
检材制备 调整pH值 去除蛋白质 结合物解离
常用蛋白质沉淀剂：
分子量较大的酸性阴离子（在酸侧沉淀）： 钨酸、磷钨酸、三氯醋酸、高氯酸等 钨酸适于酸中性毒物不适于生物碱 重金属盐（在碱侧沉淀） 高浓度中性盐（脱水盐析）硫酸铵只能用于 碱性毒物不能用于酸中性毒物 有机溶剂（变性沉淀）：适于新鲜检材
衍生化方式：
♣ 气相：柱前、柱上 ♣ 液相：柱前、柱后
1.气相色谱中的常用衍生化方法
（1）硅烷化反应
-OH
-O-SiR3
-COOH
-COO-SiR3
-SH + R3Si-X→ -S-SiR3
-NH2
-NH-SiR3
-NH
=N-SiR3
最常用衍生化试剂：BSTFA、MSTFA
（2）酰化反应
适用对象： -OH、 -SH 、-NH2 酸酐法：酸酐（吡啶或四氢呋喃溶剂）
固定相：常用硅胶，键合非或弱极性的Cl8 、C8、苯基等
（3）离子交换固相萃取
机理：易带电荷待测物质与固定相形成离子对
类型： 阳离子
阴离子
磺酸基团
季铵盐
反相萃取基本步骤：
（1）柱活化：水，甲醇洗涤
（2）待测样品处理：调节pH,去颗粒性物质 （D＞10-3）
（3）样品过柱：待测物被保留 （4）洗涤:洗弃杂质
SPME操作步骤
样品萃取 ：
1. 将SPME针管穿透样品瓶隔垫， 插入瓶中。
2. 推手柄杆使纤维头伸出针管，纤 维头可以浸入水溶液中（浸入方 式）或置于样品上部空间（顶空 方式），萃取时间大约2-30分 钟。
3. 缩回纤维头，然后将针管退出样 品瓶。
SPME-GC实验过程
三、其他前处理技术
（一）化学衍生化技术
酸化，3-5 倍 95%乙醇温浸 乙醇浸出液
水浴蒸发，3-5 倍无水乙醇浸出液过滤挥干，重复
无水乙醇浸提液 酸水溶解，过滤
酸性水溶液
乙醚萃取
乙醚 NaOH 水溶液反提
酸性水溶液 NaOH 碱化，乙醚萃取
乙醚液 中性毒物
碱水 酸化 乙醚萃取
乙醚液
酸性毒物
乙醚液 碱性毒物
碱水 pH8.5-9.3
有机溶剂萃取液
在某一检材内分布相对均 匀
含量较低，但可反映体内 总量
一般不能作为鉴定中毒的直 一般作为鉴定中毒的直接
接依据
依据
第二节 检材处理
一、检材处置
1、称量及标记
☺ 每一检材都必须称量并加标签标记 ☺ 实验过程中的留存物、废弃物及供试品等都应
标记，检验完全结束才能丢弃。
2、留样、选择及取用
➢保留样品量一般不得少于送验检材量的三分之一。 ➢不同检材不能随意混合。 ➢分取检材应能以局部检验结果代表全部，分取部 分就其外观状态、组成情况、均匀程度等尽可能与 同一检材的原有性状相同。 ➢依据分析检验方法的需要（如灵敏度、检测限）， 尽量节省检材。 ➢优先选择原则：疑点最大、可能得到线索最多、 估计含量较多、检验较易着手、检材量最多。
原理：利用待测物在互不相溶的两种溶剂之中的溶解度 差异，使待测物从一种溶剂转移至另一种溶剂中
（1）分配比（distribution coefficient)和萃取效率 分配比：D=C0/CA
D与溶质、溶剂、温度、溶质存在状态（浓度）有关
萃取率：fn=1-VAn/(VA+DV0)n 萃取原则：少量多次
衍生化目的：适应分析检测的需要
气相衍生化目的： ♣增加挥发性 ♣加强热稳定性 ♣改善色谱行为 ♣提高灵敏度、 加强选择性
液相衍生化目的： ♣提高灵敏度 ♣改善色谱行为
衍生试剂要求：
♣ 反应迅速，条件易实现 ♣ 反应定量进行 ♣ 反应副反应少，效率高 ♣ 过量衍生试剂易与待测物衍生产物分离 ♣ 衍生试剂易获得
杀虫药 杀鼠药
气体毒物 挥发性毒物
金属 毒物
水浸出 无机毒
物
液-液萃取法 液-固萃取法
顶空法 蒸馏法 扩散法
有机质破 坏法等
透析法 （4）
（1）
驱气法 （2）
（3）
法医毒物分析中常用提取净化方法示意图
毒物分析中大多数化合物的前处理属于第（1）类， 其基本操作流程如下：
预处理 分离、净化
衍生化（必要时）
注意：
用来作为对照参比而采集的一些检材有别于体外检材， 应称之为对照检材或参比检材。
二、 体内检材
体内检材指取自活体或尸体的检验材料。 包括：1.尿、血、唾液和其他体液
2.各种内脏、毛发、肌肉、皮肤、骨骼等组织 3.取自已埋尸体的组织或腐泥等。
特点：体内检材中一般已无保持原有形态或性状的药毒物
存在，经代谢后成为其他化合状态，但也有原体药毒物存在。 药毒物或代谢产物在不同组织或体液中的量可有很大差别。
结合物的解离：
适于蛋白结合率较高或其它结合度高的药毒物。 酸水解：
药物易分解 合适酸碱度、温度、水解时间
酶水解： 药物较稳定 合适酸碱度、室温（体温） β-葡糖醛酸苷酶、硫酸脂酶等
CH3 N
OH O
O
OH O
OH O
OH
O O CCH3
6-acetyl-morphine-3-glucuronide
（4）烷基化反应
2 高效液相中的常用衍生化方法
（1）紫外-可见衍生化
-NH2，-NH
对硝基苯 甲酰氯
对甲基苯 磺酰氯
异硫氰酸 苯酯
-COOH
对溴代苯甲 酰甲基溴
萘酰甲基 溴
-OH
2,5-二硝基 甲酰氯
-CHO，C=O
2,4-二硝基 苯肼
2,4-二硝基 氟苯
（2）荧光衍生化
衍生化试剂有丹酰氯，荧光胺， 芴代甲氧苯酰氯，吡哆醛及香豆素等。
两性毒物（吗啡）
改良Stats一Otto法
优点：系统分析（方向不明，目前常用于开棺检材） 缺点：检材用量大、过程繁琐、回收率低 改进：以此为基础的各种改良法 注意：分子量大的碱性物质在酸性下有可能
形成离子对，在氯仿中有一定溶解度， 不宜用氯仿萃取
3.固相萃取
（solid phase extraction,SPE)
卤代酰基法：乙酰氯，苯甲酰氯，三 氟乙酸酐，七氟丁酸酐，三氟乙酰咪 唑，和七氟丁酰咪唑等
（3）酯化反应
适用化合物：-COOH 方法：重氮烷烃法，卤化硼催化法，氢氧化铵盐 分解法和无机酸催化法。 RCOOH+CH2N2→RCOOCH3+N2 RCOOH+CH3OH→RCOOCH3+H2O RCOOH+(CH3)4NOH→ RCOON(CH3)4+H2O RCOOH+CH3OH→RCOOCH3+H2O
组织样本易堵塞固 定相
4.固相微萃取 （solid phase micro extration,SPME)
萃取针 插入
水溶液（尿、血清）
直接进气相色谱
SPME技术于1990年由加拿大Waterlop 大学Pawliszyn首创， 被称为样品处理技术上的一次革命，集采样、萃取、浓缩、 进样于一体，实现了真正意义上的无溶剂萃取技术。
固相微萃取(SPME)
➢特点
✓ 简单：操作方便，只需按动手柄。 ✓ 快速：可以节省样品预处理的70%时间。 ✓ 经济：无需溶剂及注射器，每个萃取头可以反
复使用50次以上。（最多达200次左右） ✓ 无毒害：由于无需溶剂，使操作人员的工作环
境得到改善，同时使实验室排出的毒液减低到 最小量，为我们生活的环境作出贡献。
（2）萃取方法：先制成水溶液再萃取
水相：药毒物转移到水相并以有利萃取形式存在（pH） 注意需先沉淀蛋白、除油脂、调节酸碱度
有机相：沸点不高的溶解度大的单一或混合溶剂 萃取方式：
一次，多次或连续萃取 破乳：静置、盐析、加破乳剂、适当加热、高速离心 萃取液：脱水，无水硫酸钠
（3）改良Stats一Otto法
三、体内检材与体外检材的比较
定义 类别 数量 毒物 性状
分布
毒物含量 检验结果意
义
体外检材
体内检材
体外，未经体内吸收、分布 体内，经体内吸收、分布
和代谢
和代谢
种类多而杂
种类相对固定
视情形而异
相差不大
大多具有药毒物原体 有的均匀，有的不均匀 相对较高，但不能反映总量
无原有表观性状，甚至转 化为代谢物
1、 定性分析
定性分析即确证检材中是否含有某种或 某几种药毒物，通常亦称检识或检出。检出 对象也包括药毒物在体内的代谢物，有时也 包括一些需要确证的非毒性化学物品。
定性分析的关键是检验结果的可靠性，因此 应选择合适的方法，反复验证。检验中应避 免因干扰作用而出现的假阳性或假阴性结果。
2、定量分析
定量分析即确定某种或某几种药毒物在检材的 含量，通常也称之为含量测定。
✓ 适用性强：可以随身携带，现场采样，并可在 任何型号的GC（或HPLC）仪器上直接进样。
SPME组成
SPME装置由两部分构成，手柄（Holder） 和萃取头（Fiber）状似一支色谱注射器。
手柄：用于按装萃取头，可永久使用。
萃取头：是一根涂不同色谱固定相或吸附剂的熔融 石英纤维，接不锈钢丝，外套细的不锈钢针管（保 护石英纤维不被折断及进样），纤维头可在针管内 伸缩。
（5）洗脱:有机溶剂洗脱出待测物,(D<10-3)
固相萃取装置
加压
负压
常见操作方式：
待测物随洗脱液洗脱，杂质保留，如柱层析净化。
杂质随清洗液被清洗，待测物保留，待测物再用 洗脱液洗脱，如反相萃取。
杂质和待测物均保留，待测物再用选择性洗脱液 洗脱。
固相萃取
优点 缺点
无需大量溶剂
简便
不易乳化 价格高
缀合物水解、酶解； 金属毒物硝化；沉淀 蛋白等
固相萃取
检材处理的基本步骤
1
使待测物 与大多数 杂质分开
2
分离后进 一步去除 干扰物
3
使分散在 大体积的 待测物分 散在小体 积中
4
将待测物溶 于一定量的 准确体积的 溶液中，便 于计量。
分离
净化
富集
定容
综合使用，没有严格区分
（三）方 法
毒物Leabharlann 合成毒物 天然药毒物水解
CH3 N
HO
O
OH
morphine
CH3 N
CH3 N
OH O
O
OH O
OH O
OH
O O CCH3
6-acetyl-morphine-3-glucuronide
酶解
O
HO
O
O CCH3
6-acetyl-morphine
水解与酶解的比较
2.液—液萃取
(liquid-liquid extraction,LLE)
第二章 毒物分析基础
第一节 检验材料及分类
法医毒物分析检材可大致分为： 体外检材 体内检材
一、体外检材
体外检材是指未经人体消化吸收的检验材料。
包括：1.侦查所得或现场搜集的可疑物
2.吞服不久的呕吐物或洗胃液 3.急死的胃内容（其中尚有未被消化吸收的药毒物）
特点：
体外检材中常尚有原形药毒物存在。 体外检材一般不能作为鉴定中毒的直接依据。
（或液固萃取，liquid-solid extraction）
原理：利用待测物与杂质固定相和洗脱液之 间吸附、分配、分子大小差异等进行分离
类型：正相、反相、离子交换等
（1）正相液固萃取
机理：固定相极性大于洗脱液
固定相：常用硅胶，键合极性丙氰基、二醇基、丙氨基
（2） 反相液固萃取
机理：固定相极性小于洗脱液