SDS-PAGE原理及结果分析技巧ppt课件

注意：①SDS单体的浓度，为保证蛋白质与SDS的充分结合，它们的重量比应该为 1:4或1:3； ②样品缓冲液的离子强度；③二硫键是否完全被还原，许多蛋白质是由 亚基或两条以上肽链组成的，这一类蛋白质，测定时只是它们的亚基或单条肽链的 分子量；④使用软件分析需要图片调正；⑤上样量少，条带越宽分析偏差（偏小） 越大。
➢ 不连续系统具有对样品的浓缩效应
• pH值的不连续
• 缓冲液离子成分的不连续
• 电位梯度的不连续
• 凝胶浓度的不连续以及电压的不连续.
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加样
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加电场， 样品浓缩 在界面上
电版课件
浓缩胶
(5%, pH6.8)
分离胶
(8-15%, pH8.8)
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电泳的应用
➢ 测定蛋白质分子量（亚基）；结合凝胶过滤层析
SDS-PAGE原理及结果分析技巧
20161111
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聚丙烯酰胺凝胶
➢ 聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺单体（acrylamide,Acr）和交联剂 N’N’-甲叉双丙烯酰胺（methylene-bisacrylamide, Bis）以29:1的比 例在聚合剂过硫酸铵(ammonium persulfate，APS)和催化剂
PAGE 电泳原理
➢ 分子筛效应: 分子大小和形状
➢ 电荷效应：大部分的蛋白质在pH8.3电泳缓冲液的条件下
带有负电荷，表面负电荷多的蛋白质迁移快，反之则慢
（强阴离子去污剂SDS使蛋白结构松散，并带上大量负电荷， 导致本身电荷差别消失，因此SDS-PAGE分离蛋白主要依 赖分子大小，而非电荷或形状）
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含量测定
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含量测定
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含量测定
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蛋白质水解分析
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蛋白质水解分析
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组分分析
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谢谢！
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测定分子量
非还原/还原蛋白质状态的比较：为什么要用还原性电泳测分子量？
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测定分子量
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测定分子量
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测定分子量
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测定分子量
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测定分子量
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纯度分析
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TEMED的作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶。
➢ 优点：
• 凝胶孔径可调节（改变单体和交联剂的浓度），因此可根据被分离 物的分子量范围选择合适的浓度 • 灵敏度可达1mg • 分辨率高，可分离大小相差仅3%的多肽。尤其在不连续凝胶电泳 中，集浓缩、分子筛和电荷效应为一体 • 无电渗作用，只要纯度高，操作条件一致，样品分离重复性好 • 凝胶透明，有弹性，机械效能好 • 化学性能稳定，与分离物精不选发202生1版化课件学反应; 对pH和温度变化较稳2 定
可用来测定蛋白质的分子量和聚合状态
➢ 分析纯度
➢ 测定蛋白质的含量
➢ 蛋白质水解分析
➢ 鉴定修饰（糖基化）
➢ 分离纯化
➢ 结合Western Blot、免疫共沉淀等方法可用来鉴别
蛋白质相互作用 精选2021版课件
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电泳的应用
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测定分子量
蛋白质分子量在15,000～200,000之间时，电泳迁移率与分子量的对数值线 性相关：若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量的对数作图，可 以获得一条标准曲线，而从未知蛋白质在相同电泳条件下的迁移率即可在 标准曲线上求得其分子量。