嗜热芽孢杆菌丙酮酸激酶和乳酸脱氢酶的基因克隆、蛋白表达纯化及活性分析

嗜热芽孢杆菌丙酮酸激酶和乳酸脱氢酶的基因克隆、
蛋白表达纯化及活性分析
王文珍,王慧慧,陈美雯,徐如飞,蒋培蓉,蒲首丞,巩菊芳,孙梅好
（浙江师范大学化学与生命科学学院，浙江金华321004）
摘要:偶联法测定酶的活性是常用酶活测定方法之一。

核苷二磷酸（NDP ）是核苷三磷酸的β，γ高能磷酸键水解
产物之一，丙酮酸激酶（PK ）和乳酸脱氢酶（LDH ）是用来测定NDP 生成的常用偶联酶。

为了分析嗜热菌苍白空气芽孢杆菌（Aeribacillus pallidus JH-7）（最适生长温度为50℃）的PK 和LDH 是否可以作为50℃条件下的偶联酶，研究从Aeribacillus pallidus JH-7基因组中克隆pk 和ldh ，连接到表达载体pET24a 。

结果表明，经诱导表达、纯化得到纯度达95%以上的Ap PK 和Ap LDH 。

并利用分光光度法，
分别对Ap LDH 和Ap PK 的动力学常数及催化效率进行了分析。

结果表明，Ap PK 对NDP 的最适底物为ADP ，催化效率为5×104mol/（L ·s ），最适pH 值为8.0，最适温度为45℃；NADH 为Ap LDH 的最适底物，催化效率为3.7×105mol/（L ·s ），最适pH 值为5.8，最适温度为35℃。

虽然50℃不是Ap LDH 和Ap PK 的最适温度，但它们在此温度下的k cat 分别为16.4，64.5s -1，暗示它们可以作为此温度下的偶联酶。

关键词:嗜热菌；丙酮酸激酶；乳酸脱氢酶；原核表达；酶活性测定中图分类号:Q55
文献标识码:A
文章编号:1002-2481（2019）04-0580-06
Gene Cloning ，Protein Expression ，Purification and Activity Analysis on Pyruvate Kinase
and Lactate Dehydrogenase from
WANG Wenzhen ，WANG Huihui ，CHEN Meiwen ，XU Rufei ，JIANG Peirong ，
PU Shoucheng ，GONG Jufang ，SUN Meihao
（College of Chemistry and Life Sciences ，
Zhejiang Normal University ，Jinhua 321004，China ）Abstract ：The enzyme coupling to measuring enzyme activity is one of the commonly method for enzyme activity assays.Nucleoside diphosphate （NDP ）is one of the high energy phosphate bond hydrolysates of nucleoside triphosphate.Pyruvate kinase （PK ）and lactate dehydrogenase （LDH ）are commonly coupling enzymes used to assay NDP production.To analyze whether PK and LDH of the thermophilic bacteria Aeribacillus pallidus JH-7（optimal growth temperature was 50℃）could be used as a coupling enzyme at 50℃,we cloned pk and ldh from Aeribacillus pallidus JH-7genome,and they were constructed into the expression vector pET24a.By induction and purify,we got Ap PK and Ap LDH with a purity of over 95%.The paper respectively analysed kinetic constants and catalytic efficiency of Ap LDH and Ap PK by spectrophotometry.The results showed that the optimum substrate for Ap PK was ADP,and the catalytic efficiency was 5×104mol/（L ·s ）,the optimum pH was 8.0,and the optimum temperature was 45℃.NADH was the optimum substrate for Ap LDH,the catalytic efficiency was 3.7×105mol/（L ·s ）,the optimum pH was 5.8,and the optimum temperature was 35℃.Although 50℃is not the optimum temperature for Ap LDH an Ap PK,but at this temperature,K cat was 16.4,64.5s -1,respectively,indicating that they can be used as coupling enzyme at this temperature.
Key words ：Thermophilic bacillus ;pyruvate kinase;lactate dehydrogenase;prokaryotic expression;enzyme activity determination
收稿日期:2018-10-31
基金项目:国家自然科学基金项目（30800019）；浙江省重中之重学科生物学开放基金项目（2017KFJJ001）作者简介:王文珍（1993-），女，山西大同人，在读硕士，研究方向：蛋白质的结构与功能。

孙梅好为通信作者。

丙酮酸激酶（EC2.7.1.40，PK ）催化磷酸烯醇式丙酮酸（PEP ）对核苷二磷酸（NDP ）的磷酸化产生核
苷三磷酸
（NTP ）[1-2]
和丙酮酸，二价阳离子和核苷酸形成的复合体是胞内蛋白的配体[3-5]。

不同物种来源的PK ，其反应速率达到最大反应速率1/2时的底物
浓度K m （ADP ）具有较大差异。

如大肠杆菌PKII 和蓖麻PK 的K m （ADP ）约为50mol/L [6-7]，而人和褐家鼠PK 的K m （ADP ）均大于1mmol/L [8-9]。

PK 的最适pH 大多为中性，而部分植物和刚地弓形虫的最适
pH 在8.0左右[6，10-11]。

乳酸脱氢酶（EC1.1.1.27，LDH ）
山西农业科学2019，47（4）：580-584，593580··
催化NADH还原丙酮酸生成乳酸和NAD+及其逆反应[12]。

K m（NADH），K m（pyruvate），K m（NAD），K m （lactate）在不同的物种中具有很大差别，目前报道最大的K m（lactate）是美洲螯龙虾LDH的1100mmol/ L[13]，而来自恶性疟原虫的K m（lactate）仅为47mol/ L[14]。

LDH的最适pH大多为中性，来自牛[15]和钩虫贪铜菌[16]的LDH具有目前报道的最高且最适pH值（9.8）。

PK和LDH是生物体内糖酵解过程中重要的氧化还原酶[17]，广泛存在于动植物组织和各种微生物细胞内。

通过测定NADH光吸收的变化，可以间接反映丙酮酸浓度的变化，从而可计算出PK以及LDH的酶活[12]。

大多数嗜热酶在高温条件下仍然保持很高的催化活性，所以，嗜热酶是目前研究和开发最多的酶之一。

嗜热菌是当前获得嗜热酶最直接和可靠的来源。

在浙江师范大学化学与生命科学学院蛋白质结构与功能实验室的前期工作中，发现苍白空气芽孢杆菌（Aeribacillus pallidus JH-7）为中度嗜热菌（最适生长温度为50℃），可分泌抑菌活性物质。

本研究克隆并表达嗜热芽孢杆菌丙酮酸激酶（Ap PK）和乳酸脱氢酶（A p LDH），并测定其动力学常数，分析其作为工具酶的可行性。

1材料和方法
1.1菌株与载体
嗜热苍白空气芽孢杆菌（Aeribacillus pallidus JH-7），菌株E.coli DH5α及BL21（DE3），原核表达载体pET24a，克隆载体pMD19-T simple等，均保存于浙江师范大学化学与生命科学学院蛋白质结构与功能实验室-80℃冰箱。

1.2酶与生化试剂
还原型辅酶I（NADH）、氧化型辅酶I（NAD+）、异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）、苯甲基磺酰氟（PMSF）、三磷酸腺苷（ATP）、鸟苷二磷酸（GDP）、脲苷二磷酸（UDP）、胞苷二磷酸（CDP）、腺苷二磷酸（ADP）、磷酸烯醇式丙酮酸、镍柱亲和层析树脂、溶菌酶、二硫苏糖醇、丙酮酸、L-乳酸钠和抑肽素均购自于合肥海伯莱生物技术有限公司；兔肌肉丙酮酸激酶（OcPK）、兔肌肉乳酸脱氢酶（O-cLDH）购自于罗氏公司；DNA聚合酶，dNTP Mix-ture，Bam H I，Sal I，Eco R I，Not I，Xho I等限制性内切酶购自于杭州皓丰生物技术有限公司；细菌基因组提取试剂盒（CW0552S）购自北京康为世纪生物科技有限公司；其他常规生化试剂为国产分析纯。

1.3方法
1.3.1嗜热菌pk和ldh基因克隆参照细菌基因组提取试剂盒的使用说明，提取A p JH-7基因组，并保存于-20℃以及参考贡莎莎等[18]的原核表达载体构建。

以所提基因组为模板，利用PCR扩增Appk（pk F：ACGCGTCGACCCATGCGAAAAACGAA；pk R：ATAAGAATGCGGCCGCCTCGAGTAGAACG）
和Apldh（ldh F：CCACGCGGATCCGAATTCATGAAT AAAGA；ldh R：ACGCGTCGACAATGACAGATTTCA TCGTAT）。

将纯化的PCR产物连接至pMD19-T simple载体，通过热激法转入E.coli，DH5α。

提取经测序验证含Appk和Apldh的质粒载体，双酶切相应Appk（Sal I和Not I）和Apldh（Bam H I和Sal I）载体，经琼脂糖凝胶电泳回收、纯化后分别连接到表达载体pET24a构建重组表达载体PK-pET24a，LDH-pET24a。

分别转化E.coli BL21（DE3）感受态细胞，获得Ap PK和Ap LDH的表达菌株。

1.3.2Ap PK和Ap LDH的表达、纯化参照李鸿艳等[7]和贺飞燕等[19]的方法，将表达菌株在LB培养基中培养至OD600＝0.6，加0.5mmol/L IPTG诱导表达（37℃，220r/min，3h）；离心收集菌体进行裂解、破碎、高速离心后收集上清液。

经镍柱咪唑梯度亲和层析，再经SDS-PAGE鉴定含有目的蛋白的组分，合并含高纯度目的蛋白组分，进行透析（50mmol/L Hepes，pH值8.0）。

所得目的蛋白经Bradford法[20]测定蛋白浓度后，于-80℃保存备用。

1.3.3Ap LDH活性测定利用分光光度法（瓦里安UV4000，安捷伦）测定LDH酶活[12]。

活性测定原理为LDH催化NADH的氧化或者NADH的生成，根据NADH在339nm光吸收的变化可计算出LDH 的活性。

为分析Ap LDH的最适pH，测定条件为：0.1mmol/L NADH，0.065μmol/L A p LDH，50mmol/L 磷酸盐缓冲液（pH值分别为5.2，5.4，5.6，5.8，6.2，6.4，6.6），用0.9mmol/L丙酮酸起始反应，反应温度为35℃。

为分析Ap LDH的温度稳定性，Ap LDH经不同温度（30，40，50，52，54，55，56，58，60℃）处理45min后，冷却至室温，进行活性测定。

条件为：0.1mmol/L NADH，0.065μmol/L Ap LDH，50mmol/L 磷酸盐缓冲液（pH＝6.0），反应温度为35℃。

为分析其最适反应温度，利用0.1mmol/L NADH，0.065μmol/ L Ap LDH和50mmol/L磷酸盐缓冲液（pH＝6.0），不同的反应温度（30，32，34，36，38，40℃），进行Ap LDH酶活测定。

为测定Ap LDH的动力学常数，固定一个底物浓度为10倍K m，改变另一个底物浓
王文珍等：嗜热芽孢杆菌丙酮酸激酶和乳酸脱氢酶的基因克隆、蛋白表达纯化及活性分析
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··
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度，在50mmol/L磷酸盐缓冲液（pH＝6.0）和35℃
条件下测定其反应活性，所得数据利用米氏方程
v＝V max×[s]/（K m＋[s]）（其中，V max表示最大反应
速率；[s]表示底物浓度）进行拟合，得V max及K m。

1.3.4Ap PK活性测定利用分光光度法和OcLDH
为偶联酶测定Ap PK酶活[12]。

PK活性测定原理为
PK催化NDP的磷酸化生成NTP和丙酮酸，产物之
一丙酮酸可被LDH还原为乳酸，同时NADH被氧化
为NAD+。

根据在339nm光吸收变化可计算出PK
活性产物之一丙酮酸的生成速度。

为分析其最适pH
值，活性测定条件为：50mmol/L MgCl2，0.25mmol/L
NADH，6.5mmol/L ADP，0.0473μmol/L PK，20U/mL
OcLDH，50mmol/L磷酸缓冲液（pH值分别为
5，6，7，8，9），利用1.5mmol/L PEP起始反应，反应温
度为40℃。

为分析其温度稳定性，Ap PK经不同温度
（30，40，50，55，60，65，70℃）处理45min，冷却至室
温，进行活性测定。

测定条件为：50mmol/L MgCl2，
0.25mmol/L NADH，6.5mmol/L ADP，0.0473μmol/L
PK，20U/mL OcLDH，50mmol/L磷酸缓冲液（pH＝
8.0），利用1.5mmol/L PEP起始反应，反应温度为
40℃。

为分析其最适反应温度，利用50mmol/L MgCl2，
0.25mmol/L NADH，6.5mmol/L ADP，0.0473μmol/L
PK，20U/mL OcLDH，1.5mmol/L PEP，50mmol/L磷
酸缓冲液（pH＝8.0），不同的反应温度（40，45，50，
55，60℃），进行Ap PK酶活测定。

为测定Ap PK对
NDP的磷酸化，利用最适的pH，温度为45℃，其他
条件为测定最适pH时的条件，改变NDP浓度测定
其酶活，所得数据利用米氏方程拟合，得V max及K m。

2结果与分析
2.1嗜热菌和基因克隆及蛋白表达纯化
PCR法扩增Appk和Apldh，其产物经电泳检测，
可见扩增产物大小与预期结果相符（图1，2）。

经酶
切验证及测序验证表明载体构建成功。

经表达菌株
BL21（DE3）的诱导表达、镍柱梯度亲和层析，纯化
分别获得分子量为65ku的A p PK（图3）和35ku ··
582
的Ap LDH （图4）。

2.2
PK 和
LDH 的最适pH 分析
pH 对酶的活性有较大影响。

利用不同pH 缓冲液分析A p PK 和Ap LDH 活性，结果表明，A p PK 的最适pH 值为8.0，高于8.0会导致活性急剧下降，且pH 值低于6.0时酶活性降至最大活性的1%左右；Ap LDH 的最适pH 值为5.8，且酸性条件更加容
易导致其活性下降（图5）。

2.3PK 和LDH 的最适反应温度分析
温度对酶的活性也有较大影响。

利用不同反应温度分析A p PK 和Ap LDH 活性，结果表明，
其活性受温度影响呈典型的钟型曲线（图6）。

Ap PK 和Ap LDH 的最适温度分别为50，35℃，Ap PK 在Ap LDH 的最适温度处的活性为最大活性的60%～
70%，而Ap LDH 在Ap PK 最适温度处的活性为最大活性的62%，相对来说，其活性还是很高的。

2.4
不同阳离子对
PK 和
LDH 活性的影响
利用2mmol/L 的Mn 2+或Mg 2+，20mmol/L 的Li +，200mmol/L 的K +或Na +的阳离子（一价阳离子的测定体系中Mg 2+浓度为34mmol/L ），分析了其对Ap PK 和Ap LDH 活性的影响。

结果表明，Mn 2+，Mg 2+对Ap LDH 的活性影响较小，
而极大的促进了Ap PK 的活性，且Mg 2+促进作用强于Mn 2+（除特别说明，本研究中Ap PK 活性测定体系均含有Mg 2+）。

Na +，K +和Li +对Ap PK 的活性具有抑制作用，Li +抑制效应最大，K +抑制效应最小。

Na +抑制Ap LDH 的62%活性，Li +，K +抑制其50%左右的活性（表1）。

2.5PK 和LDH 的动力学常数分析
LDH 在胞内催化丙酮酸还原为乳酸。

改变底物浓度测定其活性，经米氏方程拟合，发现Ap LDH 的K m （lactate ）高达26.2mmol/L ，而其最适底物为NADH （K m （NADH ）为34.3μmol/L ），最大反应速度k cat 为12.7s -1（表2）。

表1阳离子对
PK 和
LDH 活性的影响
表2
LDH 的动力学常数
底物NADH Pyruvate Lactate NAD +
K m /（μmol/L ）34.27±4.88480.39±119.472.62×104±7.56×103
437.20±257.00K cat /s -112.70±0.5517.15±1.77
1.06±0.14
0.48±0.15
K cat /K m /（mol/（L ·s ））
3.700.3570.0004
0.011表3
PK 对NDP 磷酸化的动力学常数
K cat /K m /（mol/（L ·s ））0.190.181.860.006K cat /K m /（mol/（L ·s ））
0.660.100.370.02K m /（μmol/L ）301±293376±2431073±1007120±100K cat /s -1199.1±1.7329.3±2.6401.2±4.8131.7±2.1
K cat /K m /（mol/（L ·s ））0.050.03
0.04
0.004
NDP ADP
UDP GDP CDP
K m /（μmol/L ）3413.5±924.42194.1±398.01648.2±367.18933.8±322.4K cat /s -1
178.4±21.8
62.1±3.964.4±5.535.3±7.6K m /（μmol/L ）240420506700K cat /s -146.574.49339.7OCPK [7]
EcPK Ⅰ[21]
Ap
PK
阳离子Mg
2+
Mn 2+Li +K +Na +
Ap PK
278.45100.700.910.950.92
Ap LDH 0.870.830.560.460.39
处理/对照
PK 在胞内催化NDP 磷酸化生成相应的NTP 。

改变NDP 浓度，
测定Ap PK 动力学常数，结果发现，其最适底物为GDP ，其K m 为1.6mmol/L 。

催化效率
最高的为底物ADP （K cat /K m 为5×104mol/（L ·s ）），最注：K cat 表示当酶被底物饱和时每秒钟每个酶分子转换底物的
分子数。

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蛋白表达纯化及活性分析583··
(下转第593页)
低为CDP （4.0×103mol/（L ·s ））（表3），不同NDP 的催化效率K cat /K m 比较结果为ADP ＞GDP ＞UDP ＞CDP ，且均低于大肠杆菌和兔肌肉PK （表3）。

2.6
PK 和
LDH 的热稳定性分析
Ap LDH 经30～50℃处理其活性稳定，在50～52℃时酶活急剧下降，60℃时基本已失活。

Ap PK
经30～50℃处理其活性稳定，基本不受温度影响，超过58℃后，其活性急剧下降（图7）。

3结论与讨论
偶联酶法作为测定酶活的方法被广泛运用。

而丙酮酸激酶与乳酸脱氢酶通常作为偶联酶，
在20～37℃测定NDP 的产生[2，
3，7，12]。

本研究从嗜热菌中克隆表达Ap PK 和Ap LDH ，可以在高温下应用于NDP 的生成酶的活性分析，以期分离鉴定能够承受
更高温度的嗜热酶，
并分析酶的活性。

本研究成功表达、纯化了A p PK 和A p LDH ，并
分析了不同pH 、温度、阳离子对其活性的影响。

结果表明，Ap PK 最适pH 值为8.0，与植物和刚地弓形虫PK 最适pH 类似；Ap LDH 最适pH 值为5.8，与嗜热脂肪土芽孢杆菌、
枯草芽孢杆菌和植物乳杆菌LDH 最适pH 类似[22-23]。

2mmol/L 二价阳离子对Ap LDH 活性有轻微的抑制作用，而二价阳离子是Ap PK 活性必需的，此结果也说明核苷酸与二价阳离子形成的复合物是激酶的底物。

高于60℃的温度对Ap PK 和Ap LDH 具有强烈灭活作用。

本研究表明，Ap PK 和Ap LDH 活性的最适温度分别为50，35℃，有意思的是，A eribacillus pallidus JH-7的最适生长温度为50℃，此温度虽然不是Ap LDH 的最适温度，但是活性还是自身最大活性的62%，k cat 为16.4s -1
，因此，确定在此温度下可以作为偶联酶。

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份续随子植株整体较为鲜嫩，光合色素含量丰富。

6月与7月相比，光照强度较低，其他各项指标也都随着光照强度的高低发生相应的变化。

8月与7月相比，光合作用的各项指标明显下降，其原因主要是环境的温度和湿度等指标发生相应变化造成的，一是植株主要进行生殖生长，处于种子油脂积累的主要时期；二是部分植株开始进入衰老期，叶片逐渐泛黄，叶绿素含量明显下降。

这与许大全[26]提出的引起植物叶片净光合速率下降的植物自身因素的2个方面相一致。

综上所述，7月份是测定续随子光合作用各项指标的最佳月份，也是续随子生长发育最好的月份，而8月是续随子种子开始积累油脂的主要时期。

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孙超超等：能源植物续随子光合特性研究
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