核磁共振光谱的应用

核磁共振是以兆周级的电磁波作用到原子核上，原子核吸收电磁波的能量发生共振跃迁，从而得到核磁共振谱线。

只有自旋量子数0≠I=1/2的原子核才有自旋现象，才能发生核磁共振。

这些原子核如1H、13C、29Si、31P、19F。

相反，12C、16O、28Si这些原子核因其自旋量子数I=0，核本身无自旋现象，因而不能发生核磁共振。

到目前为止，使用最多的核磁共振法是1H、13C核磁共振法。

近年来亦有用29Si、31P、19F核磁共振法研究木素和碳水化合物的功能基。

1.H-核磁共振法('H-NMR)'H-NM法测定对象是含H的化合物，因此木素、碳水化合物都可进行H-NMR分析。

根据不同位置的H具有不同的化学环境而在图谱中不同化学位移（）出现共振峰而进行定性分析。

峰面积与H原子数目成比例，从而亦可进行定量计算化学位移范围为0-(0~9)×10-6。

1.1'H-NMR法研究木素结构
以甘蔗渣磨木素'H-NMR谱为例，不同化学位移的峰代表的H原子见表1：
1.2'H-NMR法的试样
用'H-NMR法研究木素结构时，为了使H的信号加强，在测定前首先用吡啶：醋酸酐（1，2）使之转变为乙酰化木素，使-OH基转变成CH3CO-基，由1个H原子变成3个H原子。

'H-NMR用的溶剂应该不含H，可以用重水，氘代氯仿，以避免溶剂中的H对测定结果发生干扰。

2 13C-NMR法
13C-NMR法直接反映C原子所处的化学环境。

13C的自然丰度只有1.108%，12C自然丰度为98.89%，'H自然丰度为99.85%，因此测定时灵敏度低，但可用脉冲核磁共振加傅立叶变换法，提高其灵敏度。

13C-NMR法具有以下优点：（1）各种有机物都含C原子；（2）不同13C的化学位移值变化范围大；（3）化学环境稍有不同的13C核都有不同的化学位移值。

3 29Si-NMR法
Robert Brezny,首先报导了用29Si-NMR法测定多种模型物的三甲基硅醚衍生物的结构。

29Si的自旋量子数为I=1/2,其自然丰度只有4.7%，因此，29Si—NMR的测定灵敏度很低。

但可以使用常规INEPT技术使甲基硅醚衍生物中29Si的信号放大。

29Si-NMR主要用于研究能引进Si原子的—OH，—COOH基团及可烯醇化的羧基。

用硅醚化试剂使这些基团硅醚化，引进硅原子即可用29Si-NMR进行测定。

因而可用于研究木素、碳水化合物功能基。

3.1硅醚化方法
3.1.1硅醚化试剂
常用的硅醚化试剂是双（三甲基硅烷基）乙酰胺和二甲基氯硅烷。

3.1.2硅醚化方法
木素/模型物（20~70）mg,置于小反应瓶中，加人200ml过量的硅醚化试剂，在（60~70）℃震荡搅拌1h，在N2流中真空蒸发除去多余的试剂。

常用标准物为苯甲酰-苯胺O-henzoyl-N-phenyl-hydroxlanine。

3.2 29Si-NMR化学位移
影响29Si-NMR化学位移的主要因素有：取代基的负电性，空间的相互作用，环绕Si原子的四角排列的变化等。

所以，不同基团的29Si-NMR谱有不同的化
学位移值，谱线容易分开。

例如，在芳环上的三甲基硅醚的=（22.2~19.8）×10-6在烷基上的三甲基硅醚的=
（19.8~16.8）×10-6；在大多数木素结构中。

愈创木基中三甲基硅醚部分结构的化学位移=（20.2~20.9）×10-6；在5-5联结的二酚结构中，三甲基硅
醚的化学位移=19.1×10-6；4 31P-NMR近年来开始用31P-NMR法测定碳水化合物及木素的功能基如—COOH，—OH，C=O基，醌基等31P的自然丰度为100%。

31P—NMR测定的灵敏度高。

碳水化合物和木素都要转变为含磷的衍生物才能进行
31P-NMR分析。

4.1 31P-NMR的衍生化试剂
要把碳水化合物和木素转变为含磷的衍生物，需要用衍生化试剂。

常用的有1，3--二氧磷基氯化物、四甲基--1.3--二氧磷基氯化物和三甲基磷酸盐。

1.3--二氧磷基氯化物可以用三氯化磷（99.9%）及无水乙醇（99%）合成，经真空蒸馏提纯而制得。

它与碳水化合物或木素功能基的反应如下：
(R为酚、醇、醛、糖、羰基酸）
酚、醇、简单羧酸的磷衍生物的31P--信号都出现在能彼此分开的区域：三甲基磷酸盐能与醌型结构反应转变成含磷衍生物。

邻醌与三甲基磷酸盐的反应如下：
产物不稳定。

由于微量的水及浆中的—OH都使之水解成环状磷酸酯使信号移至=10×10-6左右。

4.2 31P-NMR法测定碳水化合物的功能基
Y.Archipov等用31P-NMR法测定碳水化合物的功能基，结果表明，a-D葡萄糖有5个-ＯＨ，在31P-NMR谱中有5个分开的峰，其化学位移=（132.4～137.8）×10-6。

测定D-木糖只有4个信号，其化学位移=（133.5～134.4）×10-6。

二糖及低聚糖中不同位置的-OH的化学位移分别为：C1--(131.9～132.7)×10-6；C5-（-132.9～133.6）×10-6；C1--(137.6～138.3)×10-6；C1或C2--(134.4～137.1)×10-6；
4.3 31P-NMR法测定木素的功能基
木素在植物原料中的含量仅次于纤维素，成为第二丰富的天然有机物。

然而木素结构的复杂性远非纤维素可比，它具有无规则的三维立体结构，不仅在自然界保持植物挺立，而且抵御微生物的侵蚀。

因此弄清木素的结构是木素化学家们面临的复杂而艰巨的任务。

为了了解木素结构特征，通常采用化学降解的方法。

例如，利用碱性硝基苯氧化降解可以测定愈疮木基、紫丁香基和对羟基苯基的比例；用酸解法生成希伯尔酮；高锰酸钾氧化法生成甲基化的苯甲酸。

这些方法只能测定非缩聚结构的木素，不能反映木素结构
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的全部情况。

所谓非缩聚结构是指木素中的苯环上的2，3，5，6位上除了有甲氧基外无其它连接，否则为缩聚型结构。

近年来，也有一些新方法，如：硫代酸解结合脱硫化反应技术可以测定包括缩聚结构的木素组成；利用芳核交换与高碘酸和硝基苯氧化结合的技术可以分析纸浆中的残余木素等。

所有这些方法都需要对木素结构进行破坏，且费时多。

非破坏性的光谱分析方法中，紫外光谱、红外光谱和'H-NMR光谱虽然对木素的化学结构提供了重要的信息，但是由于分
辨率低，提供的结构信息有限。

13C-NMR光谱可以提供定量估计木素结构单元信息，但是在实验操作时由于天然13C的丰度小，仅为1.1%,因此需要长的累加时间，结构比例的计算还依赖于甲氧基的测定。

磷-31是一种核自旋量子数不为0的原子核，其自然丰度为100%,因此，它是一种可用核磁共振技术分析含磷化合物结构的理想的原子核。

Y.Archipov等人用31P-NMR法测定木素模型物，使用Varian XL-300NMR仪，操作频率为721.5MHz及75.4MHz,信号的化学位移范围=（126~136）×10-6。

几种木素模型物的磷衍生物的化学位移见下图：
研究还表明，酚、醇、羧酸等与衍生化试剂二氧磷基氯化物反应，生成的
衍生物是定量的，苯酚芳环上的邻位取代基对31P化学位移有显著的影响，但对
位和间位取代基的影响非常小。

因此，可以明显鉴别愈创木基、紫丁香基和无
取代基的酚羟基，这些对于阐明木素结构有相当的优势。

S.Argyropoulos等用
木素模型物与衍生化试剂三甲基磷酸盐反应后的31P-NMR的化学位移为:香草醛
=28.1×10-6,紫丁香醛=12×10-6。

4.3.1原理
含有不稳定氢的化合物与磷化试剂（1）反应生成含磷的衍生物来标记这些
活泼中心，然后用31P-NMR光谱技术进行测定。

对于木素，具有这些不稳定氢活
泼中心的基团有酚羟基(Ph-OH)，脂肪羟基(aliph-OH),羧基（-COOH)，醛基(-CHO)等反映木素结构特征的官能团。

当这些基
团与磷化试剂（1）反应后，其衍生物的磷-31核磁共振谱图的化学位移处
在明显不同的区域。

由于衍生物中磷原子周围都是氧原子，因此31P-NMR的信号
都是无偶合的单峰，并且这种31P-NMR核磁共振没有NOE效应，对于定量测定官
能团极有利。

这样就能够对木素中这些重要的基团用磷化物标记后进行定量测定。

4.3.2木素中各种官能团的分析
（1）酚羟基各类酚的磷衍生物31P-NMR光谱中的化学位移在127.7~131.5
范围，一般来说，在苯环邻位
取代基对31P-NMR化学位移影响大，而对/间位取代基对31P-NMR的影响较小。

木素中存在三种基本的酚羟基，即愈创木酚、紫丁香型和对羟基苯基型的酚羟基，与磷化试剂(I)形成衍生物后，因苯环邻位取代基对31P-NMR的化学位移影响较大，它们的磷-31核磁共振的化学位移将出现在不同的区域(分别在130，132.128附近)，利用此特性可以准确定量测定各种酚羟基的含量。

(2)醇羟基醇羟基虽然存在伯、仲、叔三类。

但是在木素结构中只有前两种。

各类醇的磷衍生物的31P-NMR 光谱的化学位移在131.5~136.2范围。

一般来讲，伯醇的磷衍生物31P-NMR化学
位移较酚类羟基向低场移2，而仲醇的磷衍生物31P-NMR化学位移较伯醇向低场移0.5~2.5。

在木素中，各苯丙烷单元的最主要的键是-O-4连接。

因此伯醇羟基主要是苯环侧链的-羟基，而仲醇轻基主要是a-羟基。

具有-O-4结构的木素中又存在立体构型差异，即苏式和赤式的a-羟基。

磷标记这些羟基后，31P-NMR 光谱不仅可以区别伯羟基，而且可以区分苏式和赤式的a-羟基，这样为木素结构分析提供更加精确的信息。

(3)羧基木素中，特别是经蒸煮和漂白后的木素，羧基显得非常重要。

在31P-NMR研究中，羧酸可分两类，一类是除被磷衍生化的羧基外，无其它基团，31P-NMR的信号将出现在高场;另一类是邻二酸或a-羟基酸。

第一类羧基磷衍生物的31P-NMR化学位移出现
在127处，第二类出现两个峰，相差约7；但与普通的羧基和羟基又有所不同，这是由于反应方式不同，发生酯交换如下图：
(4)醛基醛基与磷化试剂（1）生成的衍生物，发生加成反应，如下图，
其31P-NMR化学位移在130~137范围。

另外酮与磷化试剂（1）不反应，因此用此方法尚不能测定。

4.3.3 31P-NMR光谱分析制浆漂白过程中的木素
Argyropoulos研究山毛桦经蒸汽爆破法处理溶出的木素，利用31P-NMR 光谱技术测定紫丁香型酚羟基是愈疮木型酚羟基的两倍，而总的紫丁香基与愈疮木基的比例为0.89，说明了紫丁香型结构优先游离出酚羟基。

Robert 用其它方法研究同类木素时，指出蒸汽爆破法会导致紫丁香基结构的含
-O-4连接优先断裂，两者结果相一致。

通过31P-NMR光谱计算出总的酚羟基和醇羟基分别为：0.42 mol/C9,和1.27 mol/C9，与采用国际标准方法测出的结果总的酚羟基和醇羟基分别为0.45 mol/C9,和1.26 mol/C9的结果相一致。

-O-4结构是木素中的主要连接键，此结构在木素C9单元的比例反映出木素的聚合度。

从31P-NMR光谱测定出在木素中C9连接为0.37 mol/C9，并且进
一步计算出赤式结构为0.24 mol/C9,苏式为0.13mol/C9。

证实了用13C-NMR技术研究木素时，提出的在阔叶木木素中赤式-O-4结构为主的结论。

Sun等人研究臭氧、二氧化氯、DMD及过氧化氢处理碱残余木素，利用31P-NMR技术可以准确测定其木素的羧基、酚羟基及-O-4醚键的断裂情况。

Argyropoulos用31P-NMR技术测定MILOX制浆过程中木素结构特征的变化。

在MILOX过程的第一阶段得出的愈创木型酚羟基多，表明此过程愈创木基木素优先溶出，主要是由于愈创木素富集的胞间层木素具有更大的可及性。

通过测定具有-O-4醚连接的苏式和赤式a-羟基可知具有赤式的-O-4醚键具有立体选择性优先降解。

4.4固体31P-NMR核磁共振光谱
对于纸浆，特别是磨木浆和机械浆，其木素结构中含有醛基、邻醌或对醌a、-不饱和羰基和羧基等结构。

如果将木素分离出来，这些基团容易发生变化，测出的结果不能反映浆中木素的真实特征:利用亚磷酸三甲醋可以与上述基团反应生成磷酸酯的衍生物，其固体31P-CP/MAS-NMR光谱的信号具有特征的化学位移。

Lebo和Lonsby利用此反应测定机械浆中的邻醌基团。

Argyropoulos用亚磷酸三甲酯处理磨木浆后测定固体31P-CP/MAS-NMR 光谱，发现在=10处有一个强宽峰，这是邻醌的磷酸酯衍生物重排后产物引起的。

另外，在27和35处还有两个小宽峰。

27处的峰是a,-不饱和醛的磷酸酯衍生物产生的。

而35则是有残余木素的酮式结构磷衍生物产生。

羧酸磷衍生物的化学位移亦在10左右，与邻醌重叠。

用磷微量分析方法结合非离子化和离子化样品经磷酸酯衍生化后的31P-NMR光谱，可以计算出羧基的含量，所得的结果与电导滴定
的结果基本一致。

5 19F-NMR法
19F与31P一样，自然丰度为100%，19F--NMR谱的化学位移范围宽：木素氟衍生物的稳定性好，同时氟原子在芳环上的位置对化学位移非常灵敏，容易得到各种羟基的信号，特别是可以测定碳基的含量。

这些都是31P-NMR的优点。

5. 1 19F-NMR的衍生化试剂
氟衍生物的生化试剂有几种，其中常用的有4氟基苯氯化物、4—氟苯酰甲基溴化物和4-氟苯基重氮甲基酮。

当衍生化试剂以离子型与木素的酚羟基及梭基反应后，木素的酚羟基或羧基的位置上接上氟原子。

在19F--NMR谱中的化学位移取决于氟原子在苯环上的位置以及与氟原子相联接的原子的种类。

5.2木素模型物的氟衍生物的19F-NMR测定
木素模型物与4--氟苯基氯化物，4--氟苯基溴化物，1--氟苯重氮酮反应得到的氟衍生物的化学位移。

用4--氟苯基氯化物和1-氟苯基溴化物为衍生化试剂。

模型物中酚羟基和羧基的化学位移差别很小。

因此可以用重氮甲烷使模型物甲基化及皂化后，再与4--氟
苯基氯化物反应。

羧基的化学位移可移至26.3×10-6。

因此19F--NMR法适于用来直接测定-COOH基含量。

6二维核磁共振
二维核磁共振谱使得13C-化学位移值与CH耦合常数相互关联或与直接连接H原子的质子化学位移值相互关联。

与H-和C-NMR谱相比，二维NMR谱有如下优点：木素结构单元侧链C和残糖的C峰分开，克服了13C谱中的干扰;紫丁香基、愈创木基，对香豆酸的峰分开，不受其他基团干扰。

7结语
造纸原料中碳水化合物和木素，尤其是木素大分子结构是非常复杂的，核磁共振波普技术对木素化学的研究是非常有用的，它能给出木素分子的多种信息，而一般化学分析不能提供这种这些信息，尤其是一般化学方法得到的连接键的定量数据不完善时，核磁技术能弥补这个缺陷。

相信随着该领域内新的检测技术开发和数据处理方法的使用，核磁共振最终会成为研究者分析造纸原料内部结构的一种操作简便结果。

参考文献。