HPLC在药物分析中的应用

方法学研究
线性关系考核 L 那 格 列 奈

4 2 A ＝ 4 . 6 0 × 1 0 C + 8 . 1 2 × 1 0 1 . 0 1 2 ～ 6 . 0 2 7 g / m l r＝ 0 . 9 9 9 7
C i s 那 格 列 奈
4 3 A ＝ 4 . 5 4 × 1 0 C + 1 . 0 4 × 1 0 1 . 0 0 4 ～ 6 . 0 2 4 g / m l r＝ 0 . 9 9 9 7
柱温对分离的影响
T e m p e r a t u r e （ ℃ ） T （ m i n ）T （ m i n ） R S 3 5 3 0 2 0 1 0 1 7 . 0 7 5 1 7 . 1 6 7 1 7 . 3 4 5 1 8 . 2 4 2 2 0 . 7 5 7 2 1 . 1 2 2 2 2 . 0 4 5 2 3 . 5 8 8
T （ m i n ） R 9 . 6 3 5 9 . 9 3 3 1 2 . 2 1 3 1 3 . 7 7 5 2 2 . 0 8 7 3 5 . 9 7 8 3 4 . 7 8
T （ m i n ） S 1 0 . 3 2 7 1 1 . 4 3 5 1 4 . 8 1 7 1 6 . 5 4 2 2 6 . 7 9 3 3 8 . 7 0 5 4 1 . 6 2 5
要求1、

色谱图的基线应平稳，最好进样前进行 斜率测试..\基线及斜率.jpg
要求2、

在HPLC分析中，有关物质的保留时间可 能在主成分峰之后出现，同时应视降解 物或中间体的出峰位置而定，故记录时 间一般应比主成分峰的保留时间延长2～ 3倍。
要求3、

应考虑样品配制浓度或进样量致使主成 分峰为一矩形峰，以确保样品中的有关 物质能全部检出。应按照中国药典的要 求用对照溶液调节仪器灵敏度。
含量测定方法的建立
方法验证的项目



专属性 线性 范围 准确度 精密度 检测限 LOD 定量限 LOQ 耐用性 系统适用性试验：理论板数、分离度、对称因子 ICH3-7\Q2B.PDF ICH3-7\Q2A.PDF
内标法与外标法的选择

原料药及其制剂目前一般选用外标法 生物样本多选用内标法 中药分析视情况而定
难点∶


要排除五味中药提取物对测定的干扰 要准确测定药物中微量的盐酸克仑特罗 的含量 要对两种含量相差200倍的物质同时进行 定量测定
条 件 的 选 择
最佳色谱条件
5 m m o l / L 磷 酸 二 氢 钠 ∶ 5 m m o l / L 磷 酸 氢 二 钠 （ 1 ∶ 1 ， 以 磷 酸 调 节 p H 至 6 . 2 8 ） ； 柱 温 为 1 0 ℃ ； 流 速 为 1 . 0 m l / m i n
样 品 浓 度 对 分 离 的 影 响

合成、制剂、贮藏、运输、使用，每一 过程都有可能产生有关的物质，如生产 中可能带入起始原料、试剂、中间体、 副产物和异构体等；在贮藏和运输过程 中，可能产生降解产物、聚合物或晶型 转变等特殊杂质。
初步判断能否用HPLC法进行有 关物质检查

化合物结构：样品、已知或未知杂质 现有的设备条件：检测器、色谱柱 方法建立后的实用性
说明有关物质的个数及其总量

在研究并确定了有关物质数和量的基础 上，应对若干批工艺稳定后的产品进行 分析，积累数据，对有关物质订出个数， 并对主要有关物质、未知及总的有关物 质分别订出限量，以保证产品质量。
溶剂峰的问题

进样阀的清洗 注入溶剂 流动相配制的样品是否有溶剂峰
制剂中有关物质检查
选择有关物质检查的方法


有关物质的量微小，故检测方法至关重 要，必须选择专属性强、灵敏度高、重 复性好的方法。 首选的是色谱法：TLC，HPLC及GC等， 必要时可采用HPLC/DAD、HPLC/MS 等联用技术，对有关物质进行定性定量 分析。
色谱条件的初步选择



文献调研..\risedronate.doc 色谱仪器的选择 色谱柱的选择METHOD-DEVEL.PPT 流动相的选择 检测波长的选择:待测样品、中间体、降解物 评价指标 信息反馈 虚拟试验1.ppt
研究方法的专属性




①如有关物质为已知的某中间体、副产物或降 解产物，则可在原料药中加入该杂质适量进行 试验，以证明能达到分离； ②如有关物质为未知，可用含有杂质的多批粗 品进行试验，以证明能达到分离； ③将精制品经强光、高温、高湿、氧化剂或酸 碱等分别处理，使样品光解、分解、氧化或水 解后进行试验，以证明能分离出杂质。 处理过程应定量 ..\st.doc，信息反馈
流动相pH值对分离的影响
p H T （ m i n ） T （ m i n ） R S 5 . 0 2 6 . 0 0 6 . 2 8 7 . 0 0 7 . 2 9 1 7 . 3 4 5 2 6 . 9 3 2 2 8 . 5 4 5 8 . 4 1 7 2 2 . 0 4 5 3 2 . 5 7 4 4 . 1 7 3
例1、氧氟沙星对映体的分离

手性流动相法 采用普通的C18柱， 氧氟沙星对映体.jpg
例2、那格列奈中有关物质及异 构体分析方法的研究 那格列 奈.ppt
其他方法

酒石酸衍生物手性固定相 HPLC法拆分那格列奈
色谱条件与系统适用性试验

Kromasil CHI-DMB(250mm×4.6mm） 流动相:正己烷∶异丙醇∶冰醋酸（95∶5∶0.1） 流速∶0.5ml/min，柱温∶20℃
含量测定与有关物质检查的关系



含量测定方法尽可能与有关物质检查方 法一致 在严格控制有关物质的前提条件下，含 量测定方法可不与有关物质检查方法一 致 例..\Finasteride.doc
其他问题

含量测定的浓度 操作步骤的简化
手性药物的分离和测定


HPLC的不可被替代地位 直接法 手性流动相法 手性固定相法 间接法 衍生化法
要求4、

提供的图谱应有样品批号、数据采集时 间、保留时间，文字说明，和各峰积分 值。D:\
手动积分问题

保证基线平稳积分、斜率合适 应尽量避免手动积分，以保证积分结果 的真实性、原始性
色谱图前后相关性


样品研究中的有关物质与制订标准中的 有关物质应相关 若合氯化钠60mg,置于100ml的容量瓶中,加 入 N- 甲基吡咯烷溶液 ( 取 N- 甲基吡咯烷 125mg,溶于20ml的水中,加水至100ml， 取 4ml 溶液，加上述稀硝酸至 100ml ；另 取氯化钠 60mg 同前法配液，各取溶液 100μ 加入后溶液中，混匀，测定，其分 离不小于2.0。..\N-甲基吡咯.jpg
讨 论


与通常固定相相比，蛋白质分子尺度大，对硅胶担体的 覆盖有限，再加上每一蛋白质分子含有的对映体选择性相互 作用点的数目很少，所以其样品的负载量小。 蛋白质手性固定相色谱类似于亲和色谱，对映体与蛋白 质通过疏水作用力和库仑作用力相互结合，进行对映体的手 性识别。对映体进入色谱柱后先以强的库仑作用力与蛋白质 固定相结合，而S-体比R-体结合的更稳定，当蛋白质分子上 有限的作用点被完全结合后，多余的R-体就以疏水作用力与 蛋白质结合，当浓度增加时，超出了固定相的负载量的那一 部分单体的存在，增加了体系的离子强度，使疏水作用力增 加因此这部分单体迁移时间缩短，出峰提前。


首先，对制剂在筛选处方时，应考虑辅料与主 药能否配伍，是否影响稳定性，有无干扰质量 检测；在制备过程中和贮藏期间是否会使主药 降解、聚合或转晶等。由于影响因素较多，因 此，对制剂一般应以原料药确立的有关物质检 查方法，对其有关物质进行检查研究。 如原料药较稳定，制剂经考察研究亦较稳定者， 可考虑该制剂不必再检查有关物质；但有些原 料药稳定的药物，经加工制成制剂后，有关物 质有增加；或有的原料药本身稳定性较差，对 其制剂则均应检查有关物质，并订出限量。
流动相中缓冲盐类型及浓度对 分离的影响
C o n c e n t r a t i o n
5 0 m m o l / L N a H P O 2 4 4 0 m m o l / L N a H P O 2 4 3 0 m m o l / L N a H P O 2 4 1 0 m m o l / L N a H P O 2 4 1 0 m m o l / L N a H P O + 1 0 m m o l / L N a H P O 2 4 2 4 1 5 m m o l / L N a H P O + 5 m m o l / L N a H P O 2 4 2 4 5 m m o l / L N a H P O + 5 m m o l / LN a H P O 2 4 2 4
例3
蛋白质类手性固定相HPLC法拆分 [1-乙氧甲酰基-3-苯丙基]-L-丙氨酸 对映体的方法研究
[1-乙氧甲酰基-3-苯丙基]-L-丙氨 酸的结构式
COOC 2 H 5 CH 3 CH 2 CH 2 C NH C COOH H H
色谱条件的确立




流动相中缓冲盐类型及浓度对分离 的影响 流动相pH值对分离的影响 有机溶剂的加入对分离的影响 柱温对分离的影响 流速对分离的影响 最佳色谱条件
HPLC在药物分析中的应用
HPLC在药物分析中的应用

药品的质量控制 西药、中药 生物样本中药物浓度的测定
药品的质量控制



药物分析方法的特点 方法的准确性、专属性、实用性 HPLC在新药质量控制中的应用 有关物质检查 含量测定 手性药物中对映体杂质的检查 中药分析
有关物质的来源
示例N-甲基吡咯烷

色谱条件 以电导检测器为检测器：柱子 为内径 4mm ，长度 5cm 的不锈钢管，以 每克含磺酸基 0.3meq 的 5μm 的亲水性硅 胶为填充剂；以稀硝酸 (取300ml硝酸,加 水稀释至 100000ml)- 乙腈 (60:40) 为流动 相；柱温为 35℃；流速为每分钟 1.5ml, 取对照液 100μL, 重复 5 次进样 , 峰面积的 相对标准偏差不得过5.0%；
回收率试验 L 那 格 列 奈 9 9 .1 4 % R S D ( % ) = 1 .7 6 % C i s 那 格 列 奈 9 9 .8 2 % R S D ( % ) = 2 .5 2 %
进样精密度试验 检测限 那格列奈中立体异构体及 光学异构体杂质的检查

讨

论
流动相体系中适量的异丙醇的加入，可改善 峰形，提高分离度，但加入量太多，分离度下 降。这是由于手性固定相结构中带有酰胺基团、 酯羰基和取代苯基，可以与对映体之间产生较 强的氢键作用和π -π 电子相互作用，其中氢键 作用对对映体的分离产生的影响较强。当加入 适量异丙醇可使氢键作用达到最佳值，峰形改 善分离度提高，但随着流动相中的异丙醇量增 大，它与固定相之间产生的氢键作用将抑制对 映体与固定相之间的相互作用，从而使对映体 的保留减弱，容量因子和分离度同时减小。
研究方法的灵敏度


在研究的方法具有专属性后，应考虑方 法的灵敏度。一般使最低检出量相当于 基线噪音的3倍峰高时注入的样品量。 样品、已知杂质和中间体的灵敏度
定性和定量的依据

已知对照品的方法 定性和定量有充分依据 自身对照法 峰面积归一化法 若需采用峰面积归一化法
色谱图的要求
例4、某新药对映体的分离

采用环糊精柱..\smd.jpg
HPLC在中药分析中的应用


中药原料及制剂的质量控制 特点：峰的复杂性、峰数目的不确定性、 峰面积的变化较大 含量测定、鉴别、纯品的制备
示例

复方中西药制剂中两种微量
西药成分的同时测定
喘息灵胶囊是一种止咳，平喘药，为复 方中西药物制剂,由 五味中药∶何首乌，甘草，知母，马兜 铃和五味子 两种西药∶盐酸克仑特罗（4～6μ g/0.29g） 和马来酸氯苯那敏（0.8 ～1.2mg/0.29g ）制 成