免疫学检验技术—荧光免疫技术

荧光显微镜光路图
透射荧光光路(a)
落射荧光光路(b)
三、荧光抗体染色及结果判断
• 荧光显微镜检查（结果判断）
设立实验对照:阳性对照和阴性对照 区分特异和非特异染色 阳性细胞显色分布:胞质型、胞核型和膜表面型
“-”：无或极微弱 “+”：较弱但清晰可见
“++”：明亮
“+++”：耀眼
对照光：“-”或“±”
为荧光淬灭。如紫外线照射、高温（≥20℃）、苯胺、酚、硝基 苯、I-等 。 * 荧光免疫检测中避免荧光淬灭的发生；
消除非特异性荧光（本底）的干扰。
• Stokes位移 荧光物质从激发态回到基态的过程中，由于部分能
量丢失而导致发射光波长比激发光波长，两者波长之差。 • 荧光偏振
荧光物质经单一平面的偏振光照射后，吸收光能并 发出单一平面的偏振荧光的现象。
知识目标
教学目标
1.熟练掌握：荧光抗体的制备及荧光抗体技术（重难点）。
2.掌握：常用的荧光物质，时间分辨荧光免疫测定（重点）、荧光偏振免 疫测定。
3.了解：荧光的基本知识、免疫芯片技术。
能力目标
1.掌握：荧光抗体技术标本的制作。
2.学会：荧光抗体染色与结果判断。
思政-素质目标
责任心、质控、生物安全意识、临床免疫学思维
（RB200 橘红）
CD4
三、关键技术
1.标本制作 2.荧光抗体染色 3.荧光显微镜检查 4.荧光抗体染色结果判读
标 组织切片：冷冻切片、石蜡切片 本 印片：肝、脾、淋巴结等器官或组织 制 涂片：各种体液、穿刺液、细菌和细胞悬液 作 培养细胞：单层培养细胞
冷冻切片：操作简单，抗原损失少，组织细 胞结构欠清晰 石蜡切片：组织细胞结构清楚，抗原损失多
阳性：特异荧光强度“+”以上
效价：呈"+"的血清最高稀释度
四、方法评价与应用
• 方法评价 优点：可用于抗原或抗体的定位、定
性检查，既有抗原抗体反应的高度特异性， 又能在荧光显微镜下清晰地显示其形态，直 观性强。
缺点：荧光容易消退，难以制备永久 性标本，非特异荧光常干扰结果判断。
一、荧光抗体技术的应用
五、临床应用
免疫芯片在临床分子诊断学和许多疾病诊断方面具有广泛 而重要的应用价值。 • 肿瘤标记物的检测 • 感染性疾病的检测（如肝炎病毒、结核杆菌、幽门螺杆菌等） • 心血管疾病和自身免疫性疾病的检测 • 细胞膜表面抗原的检测 • 细胞因子的检测、兴奋剂的检测 • 高通量药物筛选、环境和农业检测 • 食品卫生、生物武器等方面的检查。
• 临床应用
自身抗体检测
第四节 应用
抗核抗体(均质型)
抗核抗体(斑点型) 抗核抗体(核膜型)
荧光抗体技术的应用
病原体检测
细菌（藤黄微球菌 ) 寄生虫（猴胚肾细胞内弓形虫）
荧光抗体技术的应用
细胞表面抗原和受体检测
荧光免疫技术可用于淋巴细胞表面 CD抗原、抗原受体、补体受体、Fc受体 等的检测以及淋巴细胞及其亚群的鉴定 和计数。
三、荧光抗体的制备
制备免疫血清 亲和层析
离子交换层析法
纯化抗体荧光素 搅拌法
标记抗体
透析法
纯化
透析法 凝胶过滤法
鉴定
实际应用
荧光免疫显微技术
荧光素标记抗体与标本片中组织或细胞抗原结 合，洗涤除去游离的荧光抗体后，于荧光显微镜下 观察呈现特异性荧光的抗原抗体复合物及其存在部 位。
定性和定位检测，或对自身 抗体进行定性和滴度测定
免疫芯片技术
（immunochip） 也称抗体芯片，属于蛋白质芯片的一种，是将抗原 抗体结合反应的特异性与电子芯片高密度集成原理相结 合而建立的一种全新概念的生物芯片检测技术。
一、基本原理
免疫芯片是将几个、几十个，甚至几万个 或更多数量的抗原（或抗体）高密度排列在固 相载体上，形成高密度抗原或抗体的微点阵。 与患者的少量待检样品或生物标本同时进行特 异性免疫反应，可一次获得芯片中所有已知抗 原（或抗体）的检测结果。
• 荧光免疫测定是将抗原抗体反应与荧光物质发光分析相结 合，检测抗原抗体复合物中特异性荧光强度，进行定量测 定，分为均相和非均相。
相差聚光器 镜 头：消色差镜头
荧光显微镜的基本结构
隔热滤光片：阻断红外线通过而隔热。 激发滤光片：位于光源和物镜之间，使紫外线
（激发光）透过。 吸收滤光片：位于物镜和目镜之间，阻断激发光
而使发射的荧光透过，保护眼睛。
荧光显微镜的基本结构
光路 透射光：照明光 线从标本下方经 聚光器透过标本 进入物镜。 落射光：照明光 线从标本上方落 射到标本上，经 反射进入物镜。
四、临床应用
广泛用于微量或超微量物质的检测， 如各种激素（肽类激素、甲状腺激素、类 固醇激素等）、蛋白质、酶、药物、肿瘤 标记物及病毒抗原等的测定。
荧光偏振免疫测定
（fluorescence polarization immunoassay, FPIA） 荧光偏振免疫测定是利用抗原抗体竞争反应原理，
（一）FPIA原理
荧光偏振免疫测定示意图
二、方法评价
• 荧光素标记试剂稳定，使用寿命长重 • 复性好 • 快速，易自动化 • 适于小、中等分子物质检测 • 仪器设备昂贵，试剂盒专属性强 • 灵敏度较非均相荧光免疫测定法低
三、临床应用
主要用于测定小分子抗原物质，是临 床药物浓度测定的首选方法，目前已有多 种药物、激素、毒品和常规生化项目可以 用本方法进行分析，如环孢素、苯妥英钠、 卡马西平、地高辛、丙戊酸、苯巴比妥、 氨茶碱及鸦片浓度等测定。
激发光谱
激发光
基态（荧光物质）
发射光谱
发射光（荧光）
激发态 基态
• 荧光效率 荧光物质分子将光能转变成荧光的百分率。
荧光效率= 发射荧光的光量子数（荧光强度） 吸收光的光量子数（激发光强度）
• 荧光寿命 荧光物质被激发后所产生的荧光衰减到一定程度所用的时间。
各种荧光物质的荧光寿命不同。
• 荧光淬灭 荧光物质在某些理化因素作用下，发射荧光减弱甚至消退称
荧光抗体技术的应用
其他：如免疫病理、肿瘤等检测
肿瘤抗原（人肝癌细胞）
时间分辨荧光免疫测定
（time resolved fluoro-immunoassay, TRFIA）
时间分辨荧光免疫检测系统
时间分辨荧光免疫测定（time resolved fluoroimmunoassay, TRFIA）
一、基本原理
AbF+ Ag （组织/细胞） 紫外线 检测特异性荧光
AbF-Ag
二、方法类型
1.直 接 法 2.间 接 法 3.双标记法
直 固定Ag（待测）＋Ab*——AgAb*
接 法
Ag？
AbF
• 快，直接、干扰因素少；常用于检测Ag • 特异性高但敏感度偏低 • 检测一种Ag，需标记一种Ab，较麻烦
荧光抗体技术（定位、定性）
分类
荧光免疫分析（定量）
直接法
荧光抗体技术
间接法（重点） 双标记法
分类
补体结合法 时间分辨荧光免疫分析（重点、难点）
荧光免疫分析
荧光酶免疫分析 荧光偏振免疫分析
流式荧光免疫分析
荧光免疫技术基本知识
一、荧光的基本知识
• 荧光（fluorescence）
荧光物质吸收激发光的能量后，电子从基态跃迁到激发态 ，当其回复至基态时，发射出的波长大于激发光波长的光。
本章要点
1. 荧光免疫技术的基本原理 2. 荧光的基本知识 3. 荧光抗体染色的方法及其原理 4. 荧光抗体的制备 5. 荧光免疫测定的类型及其原理 6. 免疫荧光技术在医学检验中的应用
概述 荧光免疫技术基本知识 荧光免疫显微技术 时间分辨荧光免疫测定 荧光偏振免疫测定 免疫芯片技术
概述
概述
用镧系元素标记抗原或抗体，并与时间分辨技术相 结合而建立的一种新型超微量物质免疫分析方法，具有 灵敏度高、特异性强、发光稳定、自然荧光干扰少、标 准曲线范围宽等特点，已在临床实验中广泛应用。
一、基本原理 AgEu3＋/AbEu3＋+ Ag/Ab AgEu3＋-Ab/AbEu3＋-Ag
检测 ?Ab/Ag • 荧光寿命长：10μs-1000μs，时间差—
P FH - FL FH + FL
二、常用的荧光物质
荧光物质
异硫氰酸荧光素 (FITC)
四乙基罗丹明 (RB200)
最大吸收光谱
490nm～495nm
570nm～575nm
最大发射光谱
520nm～530nm （黄绿色）
595nm～600nm （橙红色）
四甲基异硫氰酸 罗丹明 (TRITC)
藻红蛋白（PE）
荧光免疫技术是将抗原抗体反应的特异性 与荧光检测技术的敏感性和直观性相结合而 建立的一种标记免疫技术。
三大特点 特异敏感直观
荧光免疫技术：
用荧光素标记Ab或Ag ，与待测标Ag或Ab结合，通过检 测荧光，确定标本中有无相应的Ag或Ab。
AbF(AgF)+ Ag(Ab)
AbF-Ag /(AgF–Ab)激发光荧光 检测
固定剂：乙醇、甲醇、丙酮、甲醛等 保 存：4℃、-20℃
• 荧光抗体染色
于已固定的标本上滴加经相关试剂（ 含适当稀释的荧光抗体），置湿盒内25℃ ～37℃温育30分钟左右或4℃过夜；然后 用PBS充分洗涤，待干燥后镜检。
• 荧光显微镜检查（荧光显微镜）
光 源：高压汞灯 氙灯或卤素灯
滤光片：隔热、激发和吸收 光 路：透射光、落射光 聚光器：明视野、暗视野
体
竞 争
Ag？
法
激发 固相Ab
增强液
荧光强度 与待检抗原含量
成负相关
固
相 固相Ag 抗
原
竞 争
Ag？
法
AbEu3+
激发 增强液
荧光强度 与待检抗原含量
成负相关
三、方法评价
• 灵敏度高：最小检出量10-18mol/L • 分析范围宽：4～5个数量级 • 标记物稳定：有效使用期长 • 测量快速，易自动化 • 易受污染，本底增高
时间分辨 • Stokes位移大：270nm，易分辨
长寿命 荧光
短寿命 荧光
时间分辨
Eu3+元素的stokes位移
二、方法类型
1
2
3
双抗体 夹心法
固相抗体 固相抗原 竞争法 竞争法
Eu E u
双 抗
Eu标记Ab
体
待检Ag
夹
心
固相Ab
法
每一步均需洗涤
激发 Eu解离发光
增强液
固
相
抗 AgEu3+
（一）FPIA原理
免疫芯片检测示意图
二、方法类型
1
2
液体 芯片
抗体 芯片
3
细胞 芯片
三、关键技术
• 芯片阵列项目合理组合 • 阵列所需抗体库的合理组合 • 微阵列抗体或抗原固化 • 抗原抗体在同一张芯片的集中 • 用荧光等标记免疫技术等显示结果 • 生物样品信息的获取和分析
四、方法评价
• 基于高密度抗原或抗体的微阵列技 • 高通量取得生物信息 • 信息量大、快速、及时、操作简便 • 所需样品量少、生产成本低、用途广泛 • 自动化程度高等优点。
间
接 法
Ag
荧光素标记抗抗体
Ab
抗－Ab*
• 制备一种荧光抗体，可检测多种Ag或A光素分别标记两种不同的特异性
标 抗体，与同一标本不同抗原表位反应，荧光
记 显微镜观察两种颜色荧光。如：具CD3、CD4 法 表位的Th细胞。
CD3
（FITC 黄绿） Th
550nm 490nm-560nm
碘化丙啶（PI） 488nm
Eu3+螯合物
340nm
620nm（橙红色）
595nm（红色） 620nm 613nm
应用
FAT、荧光偏振免疫测定
FITC的衬比染色或双标记 FAT
FITC的衬比染色或双标记 FAT 双标记FAT、流式细胞术 橙红色 时间分辨荧光免疫测定
根据荧光素标记抗原与其抗原抗体复合物之间荧光偏 振程度的差异，测定液体中小分子物质的含量。
一、基本原理
• 荧光物质经激发光照射后，可发出偏振荧光， 其强弱程度与荧光分子的大小呈正相关 • 荧光素标记的小分子抗原（AgF）偏振荧光 弱；而形成的AgF-Ab分子增大，偏振荧光强 • 反应体系中待测Ag与AgF竞争结合已知抗体， 故待测Ag越多，形成AgF -Ab越少，游离AgF多， 故待检Ag含量与偏振荧光强度成反比
小结
• 荧光免疫技术是将抗原抗体反应的特异性与荧光技术的敏 感性相结合，对抗原或抗体进行定性、定位或定量检测， 包括荧光抗体技术和荧光免疫测定。
• 荧光抗体技术是以荧光素标记抗体,与抗原反应, 在荧光显 微镜下观察呈现特异荧光的抗原抗体复合物，进行定性和 定位检测, 分为直接法、间接法和双标记法等。