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(收稿日期:2006-07-07
用于生产生物制品的建库哺乳动物细胞基
质的制备、鉴定和检测
白玉编译罗建辉审校
【摘要】全面鉴定和检测已建库细胞基质是控制人和动物细胞系来源的生物制品生产的重要内容,目的是为了确认生产用细胞的特性、纯度和适用性。

对于培养细胞制备的生物制品,其质量问题主要源于细胞自身和外源污染物。

经充分鉴定的细胞库不仅可以使产品始终有一个恒定的细胞来源,还能减少被其他细胞系和外源物质污染的可能性。

建库细胞的质量控制内容包括细胞鉴定以及内源和外源性微生物污染(细菌、真菌、支原体和病毒的检测。

对于生产重组DN A产品的细胞,在核酸水平(遗传稳定性对表达构建物进行分析也是一个主要问题。

有关建库细胞安全性检测计划的制订策略应当基于正确的科学原理和现行的管理指南。

【关键词】细胞库;生物技术产品
【中图分类号】R392-33【文献标识码】A【文章编号】1673-
4211(200606-0251-04
1二级细胞库系统的概念
1999年,Hayflick在关于疫苗研发用细胞基质的研究进展报告中介绍了主细胞库(M CB和工作细胞库(WCB概念的起源。

1963年的一次会议上,细胞培养委员会的分委会——国际生物制品协会微生物控制标准化委员会提出了二级细胞库系统的概念。

Hay flick建议应像制备病毒种子的系统一样运用二级细胞库系统(MCB和WCB。

早在20世纪80年代初,这个概念就用于啮齿动物细胞系,如中国仓鼠卵巢细胞(CHO和小鼠骨髓瘤细胞(Sp2/0和NS0,从而为生物制品生产的质量控制奠定了基础。

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国际生物制品学杂志2006年12月第29卷第6期Int J Biolog icals,Decemb er2006,Vol29,No.6
生物技术(尤其是重组DNA产品的快速发展,要求管理机构制定指南和考虑要点(Po ints to Consider文件来确保这些产品的质量和安全性。

关于二级细胞库系统,美国FDA生物制品评价和研究中心(CBER的考虑要点(CBER/FDA,1993;
CBER/FDA,1997、欧洲委员会的指南(CPM P/ BWP/5271/94,1995以及国际协调会议(ICH指南(ICH Q5D,1998已经提出了用于生产生物制品的细胞库的制备和鉴定的适当标准。

ICH指南中的一些建议为生产生物制品的哺乳动物细胞基质的质量控制提供了全面的方法。

2细胞库的建立
防止微生物污染的细胞基质进入现行药品生产质量管理规范(cGM P的生产设施十分重要。

在制备cGM P MCB和WCB之前,所有细胞种子和细胞基质在发放前都应该接受无菌试验(细菌和真菌和支原体检查。

细菌和真菌的检测应按美国或欧洲药典的要求进行。

支原体的检测应当使用包括琼脂和肉汤培养基的方法以及指示细胞培养程序。

这些方法在FDA/CBER生物制品用细胞系鉴定的考虑要点(CBER/FDA,1993中已有描述。

ICH文件Q5D对一级或二级细胞库系统的概念进行了描述。

所谓一级细胞库系统,是指只建立M CB而没有WCB。

如果产品每年生产只需少量细胞,可以使用一级细胞库系统。

二级细胞库系统是指先建立M CB,再用其生产WCB。

用于生产经重组DNA修饰的细胞的亲本细胞系,历史背景是否清晰对于生物制品的开发十分重要。

一般从声誉好的来源实验室,如美国标准菌种保藏中心和欧洲细胞培养物保藏中心获取亲本细胞。

一旦从细胞保藏机构获得了细胞系,科学家们就会利用遗传工程技术复制出多拷贝目的基因,生产大量蛋白质。

选择恰当的细胞基质,可以免去为得到预期的分子特性所需的额外处理步骤,因为这些细胞可以完成蛋白质翻译后的修饰(蛋白质糖基化和折叠成预期的构象。

细胞基质确定后,就要建立M CB。

M CB是指来自相同的选择性克隆,在特定条件下制备后分装于多个安瓶中,并保存于特定条件下(通常为-100℃以下的同一批次细胞。

生产过程中通常采用由M CB传建的WCB,但也可直接使用MCB。

通常M CB (100瓶,每瓶107个细胞和WCB(100~500瓶是在100级净化条件下制备的。

含有培养基与冷冻保护剂的细胞在特定条件下冷冻,细胞库分别存放在可监测的液氮罐中。

为了保证不受污染,在制备细胞库期间应启动环境监测程序。

经过充分鉴定的细胞库系统具有如下优点:(1对建库的细胞基质的鉴定和检测可证实其特性、纯度和生产适用性;(2用于生产生物制品的建库细胞能提供稳定的来源,并且保证有充足的同质细胞满足产品的需要。

3建库细胞基质的质量控制
应当对M CB进行全面鉴定和检测,包括细菌、真菌、支原体以及内源和外源性病毒在内的污染微生物。

由于W CB是由M CB在严格质控下传代而来,因此只需检测外源因子(细菌、真菌、支原体和病毒。

对体外最高代次(生产结束细胞亦需评价,以确保在生产过程中没有引入的外源因子。

上述鉴定应使用普遍敏感的检测系统与特异性检测试验(针对与待检细胞有特定联系的感染因子相结合的方法。

治疗用生物制品生产中使用的生物原材料是外源因子污染的主要来源。

近年来,为了规避这些风险,制造商已转向使用无血清、无蛋白培养基。

然而,仍有少数获得批准的生物制品使用胎牛血清作为培养基的补充成分。

当建库和生产培养基使用胎牛血清作为细胞培养添加物时,应注意确保血清经过辐照并且来自无牛海绵状脑病(BSE的地区。

如果在生产中有必要使用牛源性原材料(如血清、转铁蛋白、白蛋白和胰岛素,应建立检定程序,检测病毒和其他外源因子。

3.1原材料的检定
作为细胞培养添加物的动物源性原材料应该进行细菌、真菌、支原体和病毒的检测。

关于BSE传播问题,供应商应提供动物提取物无BSE因子的证明。

3.1.1支原体支原体的检测是由Chen等首先提出的。

FDA/CBER的考虑要点文件(CBER/FDA, 1993和欧洲药典(2003也提出应当进行支原体检测。

并要求在固体和液体培养基中培养,以及在敏感细胞系(Vero或与其相当的指示细胞基质,如NIH-3T3中培养后进行DNA染色分析。

3.1.2牛源性病毒检测用于细胞传代的牛血清应不含有传染性病毒。

但供应商提供的检测证明未必反映真实的历史,因此需要通过验证和对供货商所描述的资料进行审核,从而对来源进行确证。

关于牛源性病毒的检测,美国FDA(9CFR,
2004和欧盟(CPM P/BWP/1793/02要求至少选择两个不同的细胞系,Vero细胞
和一个牛源性细胞系(如牛鼻甲骨。

这些细胞系应该能够检测出血细胞吸附病毒和致细胞病变因子。

也可使用荧光抗体技术来检测病毒。

美国FDA和欧盟指南中要
求检测的牛源性病毒包括牛病毒性腹泻病毒、蓝舌病毒、牛腺病毒、牛呼吸道合胞病毒、牛细小病毒、3型呼肠病毒、狂犬病病毒。

除这些病毒外,还推荐采用PCR 方法检测经常污染牛血清的牛多瘤病毒。

3.2M CB的鉴定和检测
微生物和细胞污染物检测是确保生物制品生产的细胞库合格的一项重要内容。

通常参照ICH指南(ICH Q5A;ICH Q5D和FDA/CBER考虑要点中的建议来检测生物技术产品生产用MCB。

应设计一套检测项目全面检测微生物污染状况,并对细胞系进行鉴定(表1。

这种针对M CB特性和纯度的全面检测只需进行一次。

表1M CB的鉴定和检测
哺乳动物细胞系,如NS0细胞
●支原体([FDA/CBER,1993]和欧洲药典
●细菌/真菌抑制检测(USP27
●无菌试验(细菌和真菌(USP27
●外源病毒的体内检测
●组织培养安全性试验(外源病毒的体外检测
●同工酶分析
●透射电镜检查
●抗体产生试验
●逆转录病毒检测(逆转录酶、S+L-灶、XC蚀斑
●牛源和猪源病毒(只有使用牛和猪的原料时
M CB应不含任何外源因子。

已知啮齿动物的细胞能表达内源性病毒(如逆转录病毒。

因此,应该进行内源性病毒检测并报告检测结果。

应通过抗体产生试验来检测存在于啮齿动物(小鼠、仓鼠、大鼠细胞中的种属特异性病毒。

可以通过PCR试验来检测人细胞系中的病毒。

尽管仍需对二倍体细胞系进行染色体特性分析,但不再建议对传代细胞系,尤其是啮齿动物细胞系(如Sp2/0、NS0、CHO进行细胞核学检测,只要求进行同工酶检测。

因为已有这些细胞致瘤性的文献资料,故对于啮齿动物来源的传代细胞系不需要进行致瘤性试验。

3.2.1病毒的体外检测(组织培养安全性试验应将细胞溶解产物接种到能检测多种病毒的指示细胞。

建议使用人二倍体细胞系(M RC-5、猴肾细胞系(Vero以及在种属和组织类型上与用于生产的细胞相同的细胞。

可以根据细胞来源,传代史和细胞培养基中使用的原材料来选择其他指示细胞。

培养14或28天,观察有无细胞病变,检测血细胞吸附和血细胞凝集(这些现象提示有病毒污染。

在特定条件下,为了鉴别某些病毒,如人巨细胞病毒,可以延长观察期至28天。

3.2.2隐匿性病毒检测的体内试验通过接种乳鼠、成年小鼠、豚鼠和鸡胚来检测细胞培养物中检测不到的隐性病毒(组织培养试验。

体内病毒分析是用来检测各种外源病毒,而不是用来确认特殊致病因子的。

FDA和欧洲的要求有些不同。

主要区别是:美国要求使用成年小鼠,并且FDA要求通过两种途径接种鸡胚(尿囊腔和卵黄囊,而欧洲要求三种途径(尿囊腔、卵黄囊和绒毛尿囊膜。

孵育结束后,用豚鼠和鸡红细胞检测尿囊液中是否存在血凝素。

3.2.3逆转录病毒试验逆转录病毒试验应包括感染性检测、逆转录酶(RT检测和透射电镜观察。

对于啮齿动物细胞系,根据不同的情况可选择多种感染性检测方法。

对于亲嗜性和异嗜性病毒,可以通过两种方式来检测逆转录病毒:其中XC蚀斑试验是以XC 作为指示细胞,观察是否形成蚀斑来检测亲嗜性病毒;水貂细胞S+L-试验可用于检测异嗜性病毒污染。

当鼠源性逆转录病毒水平较低时,可以通过与易感细胞系(如M us dunni细胞共培养来进行扩增。

RT试验是通过检测RT活性来判断细胞外是否存在逆转录病毒颗粒。

这种检测方法的原理是以人工合成的寡核苷酸为模板,在RT的作用下将放射性标记的核苷酸聚合成互补DNA(cDNA。

哺乳动物C型逆转录病毒偏爱二价锰离子,而B、D型逆转录病毒和慢病毒属偏爱镁离子。

由于各种酶(包括细胞DNA聚合酶都能使标记的脱氧核苷酸掺入到非酸溶性物质中,所以这种方法可能存在假阳性。

由于细胞DN A聚合酶和病毒RT对于模板的选择性不同,通过比较来自DNA模板和RNA模板的结果可以消除假阳性。

也可以使用基于RT的PCR方法,这种检测方法比上述标准的酶活性RT方法更灵敏,但需要谨慎解释试验结果。

因为并非逆转录病毒独有RT活性,RT活性还有其他来源,例如不能编码完整基因组或细胞DNA聚合酶的逆转录病毒样元件。

透射电镜可用来观察细胞基质超微结构的形态
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学特征以及病毒和病毒样颗粒的存在(A、B、C、D和R型。

多数啮齿动物细胞(如小鼠杂交瘤、NS0、Sp2/0和CHO可以表达由细胞膜芽生或者处于细胞外的C型颗粒以及脑池内A型颗粒。

但是,BH K 细胞可表达低水平的脑池内R型颗
粒。

3.2.4选择性病毒的检测用抗体产生试验检测可能存在于啮齿动物细胞基质中的种属特异性病毒,小鼠抗体产生试验可检测16种鼠病毒,仓鼠抗体产生试验可检测5种病毒,大鼠抗体产生试验可检测9种病毒(ICH Q5A。

试验过程如下:通过不同途径(口、鼻、腹腔和颅内将供试物接种到无病毒动物体内,在规定时间后检测血清
抗体水平。

淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒(LCM V的体内检测包括颅内接种后再进行LCM V攻击。

使用适当的体外试验或PCR分析可以检查人源细胞基质中是否存在人源病毒致病因子,如EB病毒、巨细胞病毒、人逆转录病毒(人嗜T淋巴细胞病毒和人免疫缺陷病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、6和7型人疱疹病毒、细小病毒B19、多瘤病毒属(JC病毒和BK病毒和16和18型人乳头状瘤病毒。

3.3WCB的鉴定和检测
由于WCB来源于M CB且培养时只传几代,故仅需对外源因子进行有限的检测。

提议只采用以下试验对WCB进行一次鉴定:无菌试验、支原体检查、同工酶分析和组织培养安全性试验。

3.4生产结束细胞或体外最高代次细胞的检定
生产细胞通常通过扩增WCB获得。

在生产结束时,应该评估这些细胞(生产结束或体外最高代次是否存在M CB中未检测到的内源性病毒以及在生产过程中是否引入污染物。

对这些细胞只需进行一次鉴定。

只有当启用新的WCB、改变细胞培养基或扩大生产规模的情况下,才有必要进行再检验。

3.5细胞基质的遗传稳定性
细胞基质稳定性的主要问题是能否持续稳定地生产重组DNA蛋白和在特定条件下贮存时仍保留生产的能力。

故应对比分析生产细胞(M CB和体外最高代次细胞(生产结束细胞,EPC的遗传稳定性。

应验证表达构建物中编码重组蛋白序列的正确性。

从样本DNA中PCR扩增的DNA或由供试物(M CB 和EPC分离的RNA制备的cDNA用于进行DNA 序列分析。

通过限制性内切酶谱和DNA印迹试验来检测基因表达质粒的完整性,以确定质粒的拷贝数,并检测是否有大的序列插入或缺失。

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(收稿日期:2006-02-21
《国际生物制品学杂志》
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