酶免疫技术—酶免疫技术的概述(免疫学检验课件)
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（2）酶标记率测定：用分光光度法分别测定结合 物中酶和抗体(抗原)蛋白的含量，然后按公式计算 其标记率。
四、固相载体
（一）固相载体的要求
①可结合抗原或抗体及亲和素或链霉亲 和素等大分子；
②结合抗体(抗原)的容量大，结合稳定； ③固相化后分子仍应保持活性； ④固相化方法应简便、快速。
（二）固相载体的种类
三、酶标记物的纯化与鉴定
1．酶标记物的纯化 标记完成后应除去反应溶液中的游离酶、游
离抗体(抗原)、酶聚合物及抗体(抗原)聚合物， 避免游离酶增加非特异显色以及游离抗体(抗原) 的竞争作用。
常用的纯化方法有葡聚糖凝胶层析法和饱和 硫酸铵沉淀法等。
2.酶标记物的鉴定
（1）酶活性及免疫活性鉴定：常用免疫电泳或双 向免疫扩散法，出现沉淀线表示结合物中的抗体 (抗原)具有免疫活性。沉淀线经漂洗后加底物能显 色 ，表示标记物中的酶仍具有活性。
酶免疫技术
酶免疫技术：以酶标记的抗体或抗原作为
主要试剂，将抗原抗体反应的特异性和酶
催化底物反应的高效性和专一性相结合的 一种免疫检测技术。
抗体(抗原)的免疫学活性 酶标记抗体(抗原)
酶对底物的催化活性
酶
底物
显色
定பைடு நூலகம்、定位、定量
基本原理
酶免疫分析技术的原理是利用酶标记抗体 (抗原)形成酶标抗体(抗原)结合物，此结合物既 保留抗体(抗原)的免疫活性，又保留了酶对底物 的催化活性。酶标抗体(抗原)与相应抗原(抗体) 进行反应后，酶催化相应的底物显色，借助酶作 用于底物的显色反应来判定结果。
（一) 戊二醛交联法
戊二醛分子中有两个相同的醛基，可分别与 酶和抗体（抗原）分子上的氨基结合。该法有一 步法和二步法。二步法标记效率比一步法高，酶 标记物质量较均一。
（二) 改良过碘酸钠法
仅用于HRP的标记。可与抗体蛋白的游离氨 基结合，形成HRP-CH2-NH-IgG。有人认为是最 好的方法，也有人认为试剂过于强烈，实验重复 性不够好。
（二）常用的酶和底物
1.辣根过氧化物酶(HRP) 糖蛋白(主酶)+亚铁血红素(辅基)
酶质量
纯度(RZ)= A403nm/A275nm RZ>3.0 活性:在25度条件下1分钟将1微克底物转化为产物的酶量为1个单位
RZ值与酶活性无关，酶活性单位比RZ值更为重要
在ELISA中HRP的底物为过氧化物和供氢体（DH2）， 目前常用的过氧化物是过氧化氢， H2O2十DH2—D十2H20
1．塑料制品 由聚苯乙烯、聚氯乙烯制成。形状 主要有微量反应板、小试管和小珠三种。
2．微颗粒 微颗粒是由聚苯乙烯高分子单体聚合 成的微球或颗粒。
3.微孔虑膜 是一种多孔薄膜过滤材料，包括硝酸 纤维素膜（NC）、尼龙膜和玻璃纤维素膜等。
微量反应板
酶联免疫吸附试验（ELISA）三 大必备试剂：酶标志物、酶对应 的底物、固相载体
Y Y
酶标抗体 抗原 底物
酶免疫技术的分类
酶免疫技术
酶免疫组织化学技术
酶放大免疫测定技术
均相酶免疫测定
酶免疫测定技术
克隆酶供体免疫测定
非均相酶免疫测定
固相酶免疫测定 (ELISA)
液相酶免疫测定
酶免疫技术的概述
一、常用的酶及底物
（一）标记酶的条件： ①活性高，纯度高 ②作用专一性强 ③性质稳定，易与抗原或抗体偶联 ④测定方法简便易行、敏感、精确 ⑤酶和底物对人体无害 ⑥酶和底物价廉易得
酶作用后，生成高强度荧 光物 ，用荧光计测量。
4.其他酶
在商品试剂中，经常应用的酶还有葡萄糖 氧化酶(GOD) 、6-磷酸葡萄糖脱氢酶、溶菌酶、 青霉素酶、脲酶、苹果酸脱氢酶等。
二、制备酶标记抗体(抗原)的方法
制备要求： 抗原要求纯度高、抗原性强。 抗体则要求特异性强、效价高、亲和力强、 易于分离纯化和批量生产。
邻苯二胺 OPD
常用底物
四甲基联苯胺 TMB 5-氨基水杨酸5-ASA
2,2′-氨基-二(3-乙基-苯并噻唑 啉磺酸-6)铵盐 ABTS
OPD（邻苯二胺 ）反应后显橙黄色，加酸终止反 应后呈棕黄色，测定波长492nm。不稳定，有 致癌性。
TMB（四甲基联苯胺 ）反应后显蓝色 ，加酸终止 反应后变为黄色,测定波长450nm ，稳定，无致 癌性，ELISA中应用最广泛的底物。
2.碱性磷酸酶(ALP)
是一种磷酸酯水解酶，从大肠杆菌提取
AP的 底物
对-硝基苯磷酸 酯（ pNPP ）
经AP作用后的产物为黄色对
硝基酚，最大吸收峰波长为 405 nm。
3.β-半乳糖苷酶（ β-Gal ）
源于大肠埃希菌 ，常用于均相酶免疫测定。
β-Gal 的底物
4-甲基伞酮基βD半-乳糖苷 （ 4MUG ）
四、固相载体
（一）固相载体的要求
①可结合抗原或抗体及亲和素或链霉亲 和素等大分子；
②结合抗体(抗原)的容量大，结合稳定； ③固相化后分子仍应保持活性； ④固相化方法应简便、快速。
（二）固相载体的种类
三、酶标记物的纯化与鉴定
1．酶标记物的纯化 标记完成后应除去反应溶液中的游离酶、游
离抗体(抗原)、酶聚合物及抗体(抗原)聚合物， 避免游离酶增加非特异显色以及游离抗体(抗原) 的竞争作用。
常用的纯化方法有葡聚糖凝胶层析法和饱和 硫酸铵沉淀法等。
2.酶标记物的鉴定
（1）酶活性及免疫活性鉴定：常用免疫电泳或双 向免疫扩散法，出现沉淀线表示结合物中的抗体 (抗原)具有免疫活性。沉淀线经漂洗后加底物能显 色 ，表示标记物中的酶仍具有活性。
酶免疫技术
酶免疫技术：以酶标记的抗体或抗原作为
主要试剂，将抗原抗体反应的特异性和酶
催化底物反应的高效性和专一性相结合的 一种免疫检测技术。
抗体(抗原)的免疫学活性 酶标记抗体(抗原)
酶对底物的催化活性
酶
底物
显色
定பைடு நூலகம்、定位、定量
基本原理
酶免疫分析技术的原理是利用酶标记抗体 (抗原)形成酶标抗体(抗原)结合物，此结合物既 保留抗体(抗原)的免疫活性，又保留了酶对底物 的催化活性。酶标抗体(抗原)与相应抗原(抗体) 进行反应后，酶催化相应的底物显色，借助酶作 用于底物的显色反应来判定结果。
（一) 戊二醛交联法
戊二醛分子中有两个相同的醛基，可分别与 酶和抗体（抗原）分子上的氨基结合。该法有一 步法和二步法。二步法标记效率比一步法高，酶 标记物质量较均一。
（二) 改良过碘酸钠法
仅用于HRP的标记。可与抗体蛋白的游离氨 基结合，形成HRP-CH2-NH-IgG。有人认为是最 好的方法，也有人认为试剂过于强烈，实验重复 性不够好。
（二）常用的酶和底物
1.辣根过氧化物酶(HRP) 糖蛋白(主酶)+亚铁血红素(辅基)
酶质量
纯度(RZ)= A403nm/A275nm RZ>3.0 活性:在25度条件下1分钟将1微克底物转化为产物的酶量为1个单位
RZ值与酶活性无关，酶活性单位比RZ值更为重要
在ELISA中HRP的底物为过氧化物和供氢体（DH2）， 目前常用的过氧化物是过氧化氢， H2O2十DH2—D十2H20
1．塑料制品 由聚苯乙烯、聚氯乙烯制成。形状 主要有微量反应板、小试管和小珠三种。
2．微颗粒 微颗粒是由聚苯乙烯高分子单体聚合 成的微球或颗粒。
3.微孔虑膜 是一种多孔薄膜过滤材料，包括硝酸 纤维素膜（NC）、尼龙膜和玻璃纤维素膜等。
微量反应板
酶联免疫吸附试验（ELISA）三 大必备试剂：酶标志物、酶对应 的底物、固相载体
Y Y
酶标抗体 抗原 底物
酶免疫技术的分类
酶免疫技术
酶免疫组织化学技术
酶放大免疫测定技术
均相酶免疫测定
酶免疫测定技术
克隆酶供体免疫测定
非均相酶免疫测定
固相酶免疫测定 (ELISA)
液相酶免疫测定
酶免疫技术的概述
一、常用的酶及底物
（一）标记酶的条件： ①活性高，纯度高 ②作用专一性强 ③性质稳定，易与抗原或抗体偶联 ④测定方法简便易行、敏感、精确 ⑤酶和底物对人体无害 ⑥酶和底物价廉易得
酶作用后，生成高强度荧 光物 ，用荧光计测量。
4.其他酶
在商品试剂中，经常应用的酶还有葡萄糖 氧化酶(GOD) 、6-磷酸葡萄糖脱氢酶、溶菌酶、 青霉素酶、脲酶、苹果酸脱氢酶等。
二、制备酶标记抗体(抗原)的方法
制备要求： 抗原要求纯度高、抗原性强。 抗体则要求特异性强、效价高、亲和力强、 易于分离纯化和批量生产。
邻苯二胺 OPD
常用底物
四甲基联苯胺 TMB 5-氨基水杨酸5-ASA
2,2′-氨基-二(3-乙基-苯并噻唑 啉磺酸-6)铵盐 ABTS
OPD（邻苯二胺 ）反应后显橙黄色，加酸终止反 应后呈棕黄色，测定波长492nm。不稳定，有 致癌性。
TMB（四甲基联苯胺 ）反应后显蓝色 ，加酸终止 反应后变为黄色,测定波长450nm ，稳定，无致 癌性，ELISA中应用最广泛的底物。
2.碱性磷酸酶(ALP)
是一种磷酸酯水解酶，从大肠杆菌提取
AP的 底物
对-硝基苯磷酸 酯（ pNPP ）
经AP作用后的产物为黄色对
硝基酚，最大吸收峰波长为 405 nm。
3.β-半乳糖苷酶（ β-Gal ）
源于大肠埃希菌 ，常用于均相酶免疫测定。
β-Gal 的底物
4-甲基伞酮基βD半-乳糖苷 （ 4MUG ）