中药材桔梗及其易混品的DNA条形码分子鉴定

2021年河北大学学报(自然科学版)2021第41卷第1期J o u r n a l o fH e b e iU n i v e r s i t y(N a t u r a l S c i e n c eE d i t i o n)V o l.41N o.1 D O I:10.3969/j.i s s n.10001565.2021.01.009
中药材桔梗及其易混品的D N A条形码分子鉴定
赵新悦1,2,刘蕊1,2,冯红2,毛雯雯2,曹飞1,张兰兰2
(1.河北大学药学院,河北保定071002;2.数字本草检测科技有限公司,河北保定071002)
摘要:为了特异性地鉴别桔梗药材P l a t y c o d o n g r a n d i f l o r u m及其易混品,通过优化D N A提取方法,并基于I T S(i n t e r n a l t r a n s c r i b e d s p a c e r)序列上的特异性位点,设计特异性引物,进行特异性P C R扩增,以扩增成功率为判定指标快速鉴别桔梗药材真伪.研究结果表明,改良C T A B(c e t y l t r i m e t h y l a mm o n i u m b r o m i d e)法提取D N A较纯且100%扩增成功;基于桔梗293位和538位的特异性位点,设计特异性引物U1/D1,且特异性P C R鉴别中,仅桔梗能扩增得到约264b p的特异性条带,其他药材均为阴性扩增.I T S序列以及特异性引物可准确鉴别桔梗及其常见易混品,为桔梗药材的基原鉴定提供科学依据.
关键词:桔梗;I T S;特异性引物;分子鉴定
中图分类号:R927.11文献标志码:A 文章编号:10001565(2021)01006008 M o l e c u l a r i d e n t i f i c a t i o no f P l a t y c o d o n g r a n d i f l o r u m a n d
i t s c o m m o nm i s c i b l e u s i n g D N Ab a r c o r d i n g
Z H A OX i n y u e1,2,L I UR u i1,2,F E N GH o n g2,M A O W e n w e n2,C A OF e i1,Z H A N GL a n l a n2
(1.C o l l e g e o f P h a r m a c y,H e b e iU n i v e r s i t y,B a o d i n g071002,C h i n a;2.D i g i t a lM a t e r i a l
M e d i c a lT r a d i t i o n a l C h i n e s eM e d i c i n eT e s t i n g C o.L t d.,B a o d i n g071002,C h i n a)
A b s t r a c t:T o s p e c i f i c a l l y i d e n t i f y P l a t y c o d o n g r a n d i f l o r u m a n d i t sm i s c i b l e p r o d u c t s,am e t h o dw a s e s t a b l i s h e db y o p t i m i z i n g D N Ae x t r a c t i o n m e t h o d,d e s i g n i n g s p e c i f i c p r i m e r sb a s e do nt h eI T S(i n t e r n a l t r a n s c r i b e ds p a c e r)s e q u e n c e,a n d c a r r y i n g o u ts p e c i f i c P C R a m p l i f i c a t i o n.T h e a u t h e n t i c i t y o f P.
g r a n d i f l o r u m w a s q u i c k l y d e t e r m i n e db y t h ea m p l i f i c a t i o ns u c c e s sr a t e.T h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h e m o d i f i e dC T A B(c e t y l t r i m e t h y l a mm o n i u m b r o m i d e)m e t h o d g a v er e l a t i v e l yp u r eD N Aa n da m p l i f i c a t i o n w a s100%s u c c e s s f u l,s p e c i f i c p r i m e r sU1/D1a n d s p e c i f i c P C Rw e r e d e s i g n e db a s e d o n t h e s p e c i f i c s i t e s o f P.g r a n d i f l o r u m293a n d538.I nt h e i d e n t i f i c a t i o n,o n l y P.g r a n d i f l o r u m c a nb ea m p l i f i e dt oo b t a i na 264b p s p e c i f i cb a n d,a n do t h e r m e d i c i n a lm a t e r i a l sw e r en e g a t i v e.T h eI T Ss e q u e n c ea n dt h ed e s i g n e d s p e c i f i c p r i m e r s c a nb e a p p l i e d t o i d e n t i f i c a t i o no f t h e P.g r a n d i f l o r u m a n d i t s c o mm o nm i s c i b l e p r o d u c t s, w h i c hs h o u l d p r o v i d e s c i e n t i f i c e v i d e n c e f o r o r i g i n i d e n t i f i c a t i o no f P.g r a n d i f l o r u m.
K e y w o r d s:P l a t y c o d o n g r a n d i f l o r u m;I T S;s p e c i f i c p r i m e r s;m o l e c u l a r i d e n t i f i c a t i o n
收稿日期:20191120
基金项目:国家自然科学基金资助项目(41606174);河北省高等学校科学技术研究项目(B J2020048)
第一作者:赵新悦(1993 ),女,河北保定人,河北大学硕士研究生.E-m a i l:834281153@q q.c o m
通信作者:曹飞(1988 ),男,河南南阳人,河北大学副教授,主要从事渤海来源真菌资源中的药物先导化合物的筛选和发现研究.E-m a i l:c a o f e i@h b u.e d u.c n
张兰兰(1977 ),女,河北沧县人,数字本草检测科技有限公司副研究员,主要从事中药标准研究开发及标准提
升等.E-m a i l:z h a n g l l2@t a s l y.c o m
16第1期赵新悦等:中药材桔梗及其易混品的D N A条形码分子鉴定
中药桔梗[1]为桔梗科植物桔梗P l a t y c o d o n g r a n d i f l o r u m的干燥根,具有宣肺㊁祛痰㊁利咽㊁排脓之功效.研究表明,桔梗中主要活性成分桔梗皂苷D可明显降低白色念珠菌对口腔黏膜的感染.皂苷D㊁D3和远志皂苷D可抑制人癌细胞株的增殖[2],桔梗多糖对宫颈癌实体瘤小鼠肿瘤生长有显著的抑制作用[3].此外,桔梗还具有降血糖㊁抗氧化的功效[4].丰富的药理作用,使得桔梗药材被广泛应用.然而,桔梗市场一直存在真伪混杂现象.因外形相似不易区分,有些不良商家以南沙参(A d e n o p h o r a t e t r a p h y l l a)㊁霞草(G y p s o p h i l ao l d-h a m i a n a)掺入或冒充桔梗售卖[5],但南沙参清热养阴,霞草活血散淤,作为桔梗应用于临床时不能宣肺利咽,很大程度上延误患者病情,如若将霞草误认为桔梗使用时,可能引起患者出血增多,为临床增加了不必要的风险.目前,徐优芬[6]㊁王千枝[7]㊁万秋娥[8]等采用植物形态㊁药材性状㊁显微鉴别㊁激光拉曼光谱等方法对桔梗及其易混品进行鉴别,其方法本身对技术人员的专业技术能力要求较高,其结果重复性差㊁工作量大.
目前,D N A条形码技术已成为中药材鉴定的重要方法[9].2010年中国学者提出将I T S2(i n t e r n a l t r a n-s c r i b e d s p a c e r2)作为药用植物标准D N A条形码[10],且已成功应用于豆科等多个科属药用植物及药材鉴定[11-13].已有研究表明[14],基于I T S基因序列的桔梗及其伪品的基源植物构建邻接法(N J)聚类树,桔梗样品可聚成一个单系,但对其位点特异性P C R鉴定未见相关报道.
本文以桔梗㊁南沙参㊁霞草为研究对象,优化D N A提取方法和设计桔梗特异性引物,对桔梗进行特异性P C R鉴定.本方法操作简单,快速,无需测序,可特异性鉴别桔梗及其易混品,为桔梗药材的基原鉴定提供科学依据,并进一步完善桔梗药材质量控制系统.
1仪器和材料
1.1仪器
L D Z M-20K C SⅢ立式压力灭菌锅(上海申安);S c i e n t z-48高通量组织研磨器(宁波新芝生物);L e g e n d M i c r o17离心机(T h e r m oF i s h e r S c i e n i f i c);E p o c h酶标仪(伯腾);A B I p r o f i l e梯度P C R仪(L i f eT e c h n o l o-
g i e s);D Y C P31D N电泳仪(北京六一生物);J S-680D凝胶图像分析系统(上海培育科技).
1.2材料
本实验所用样品均购自药材市场,收集后放置于硅胶中常温干燥保存,备用;样品共计17批,均经本公司鉴定人员鉴定,样品信息详见表1.
表1实验所需植物材料
T a b.1P l a n tm a t e r i a l r e q u i r e d f o r t h e e x p e r i m e n t
2实验方法
2.1基因组D N A的提取
随机选择桔梗㊁南沙参㊁霞草样品各2批,采用体积分数为75%的乙醇对样品表面擦拭消毒并置于洁净处挥干,使用高通量组织研磨仪研磨,称取样品粉末30m g于2m L离心管中,采用植物基因组D N A提取试剂盒法㊁改良C T A B(c e t y l t r i m e t h y l a m m o n i u mb r o m i d e)法㊁S D S(s o d i u md o d e c y l s u l f a t e)法3种D N A提取方法进行实验(表2).并以通用引物I T S2F/3R进行P C R扩增[15],以D N A浓度㊁纯度与P C R扩增成功率为评判指标,选择最适合桔梗及其易混品药材D N A提取的方法.
表2基因组D N A提取方法比较
T a b.2C o m p a r i s o no f g e n o m i cD N Ae x t r a c t i o nm e t h o d s
提取方法操作步骤
植物基因组D N A提取试剂盒法①细胞裂解:向样品粉末中加入400μL缓冲液L P1和6μLR N a s e A(10m g/m L),旋涡振荡1m i n,室温放置10m i n.
②D N A抽提:在上述溶液中加入130μL缓冲液L P2,充分混匀,漩涡振荡1m i n,12000r/m i n离心5m i n,将上清液移至新的离心管中.
③D N A沉淀:所得上清液中加入1.5倍体积的缓冲液L P3,立即充分振荡混匀15s,此时可能会出现絮状沉淀.将所得溶液和絮状沉淀全部加入吸附柱C B3(吸附柱放入收集管中),离心30s,倒掉废液,将吸附柱C B3放入收集管中.
④D N A洗涤㊁溶解:向C B3中加入600μL漂洗液P W,离心30s,倒掉废液.重复洗涤1次.C B3放回收集管中,离心2m i n,倒掉废液,并置于室温放置数分钟后,将C B3置于干净离心管中,向吸附膜中间部位悬空加入100μLT E缓冲液,室温放置2~5m i n,离心2m i n,将溶液收集到离心管中,4ħ保存备用.
改良C T A B法①细胞裂解:向样品粉末中加入800μLC T A B提取液65ħ水浴2h.期间振荡混匀.
②D N A抽提:上述溶液以12000r/m i n离心3m i n后取上清液,加入1/10体积C T A B㊁N a C l,等体积的氯仿-异戊醇(体积比24ʒ1),混匀,离心3m i n;取上清液,加入等体积的氯仿-异戊醇(体积比24ʒ1),混匀,离心3m i n.
③D N A沉淀:取上清液,加入2倍体积的-20ħ预冷的无水乙醇,于-20ħ静置15m i n,离心3m i n.
④D N A洗涤㊁溶解:弃去上清液,加入700μL体积分数为70%的乙醇,洗涤沉淀1次;700μL无水乙醇洗涤沉淀1次.自然晾干.加入100μLd d H2O溶解,于-20ħ下冷冻保存.
S D S法①细胞裂解:向样品粉末中加入800μLS D S提取液,振荡混匀,置于65ħ水浴保温1h,期间振荡混匀数次,使样品与提取液充分混合,冷却至室温.
②D N A抽提㊁沉淀.洗涤和溶解:同改良C T A B法.
2.2序列分析
将测序获得和N C B I网站下载的桔梗㊁南沙参㊁霞草的I T S基因序列(登录信息见表3)用M E G A7.0软件进行序列查看,用C l u s t a lW进行多序列比对,删除前后两端多余的序列,并计算种间和种内的遗传距离.基于K i m u r a-2-p a r a m e t e r双参数模型用N J将比对过的序列构建系统发育树,用自举检验法(b o o t s t r a p1000次)检验各分支的支持率.
表3N C B I下载的各基因序列信息
T a b.3N C B I d o w n l o a d e d g e n e s e q u e n c e i n f o r m a t i o n t a b l e
26河北大学学报(自然科学版)第41卷
第1期赵新悦等:中药材桔梗及其易混品的D N A条形码分子鉴定
2.3特异性引物设计
通过M E G A7.0分析比较桔梗及其易混品的I T S序列差异,查找桔梗的特异性位点.基于特异性位点设计桔梗特异性引物,并送至北京美吉桑格生物有限公司进行合成.利用该引物对各药材D N A进行特异性P C R扩增,以验证引物的可用性.
2.4桔梗位点特异性P C R方法建立
基于本研究提取的桔梗及其易混品的基因组D N A和设计的桔梗特异性引物U1/D1,建立桔梗位点特异性P C R方法,并对其进行P C R条件优化.
本研究分别考察了引物U1/D1的退火温度㊁循环次数㊁D N A模板浓度以及引物浓度等因素对P C R反应效率的影响,筛选最适P C R扩增条件.各因素具体参数设计如下:
退火温度考察分别设置为56㊁58㊁60㊁62ħ;循环次数考察分别设置为33㊁35㊁37㊁39个循环;D N A模板考察分别设置为50㊁100㊁200㊁400n g;最适引物浓度考察分别设置为0.5㊁1.0㊁2.5㊁5.0μm o l/L.
最后,为了进一步检验桔梗位点特异性,将所有样品基因组D N A进行扩增,同时设置未加模板D N A的P C R反应为空白对照.
3结果与分析
3.1基因组D N A的提取
D N A纯度常以A260/A280来表示,1.8~2.0表示所提取的D N A纯度较好,小于1.8说明有蛋白质污染,大于2.0说明有R N A残留.从表4可知,3种方法提取的D N A均有污染,试剂盒法提取基因组D N A平均纯度为0.76,所提D N A中含有较多蛋白质,改良C T A B法为2.13,S D S法为2.20,有少量R N A残留.而选取相同样品量时,改良C T A B法和S D S法所提D N A质量浓度均在120n g/μL以上,而试剂盒法提取D N A质量浓度只有20n g/μL.就提取D N A的纯度和质量浓度而言,改良C T A B法ʈS D S法>试剂盒法.
表43种方法所提取的D N A质量汇总
T a b.4S u m m a r y o fD N A q u a l i t y e x t r a c t e db y t h e t h r e em e t h o d s
样品
D N A纯度(A260/A28)
试剂盒法改良C T A B法S D S法
ρ(D N A)/(n g㊃μL-1)
试剂盒法改良C T A B法S D S法
J1 J2 N1 N2 X1 X20.62
0.59
0.87
0.92
0.71
0.82
2.35
2.40
1.96
1.95
2.01
2.12
2.39
2.40
2.01
2.01
2.19
2.21
23.52
22.69
21.68
25.22
32.13
35.26
153.26
161.31
155.47
159.51
156.33
149.84
132.68
130.27
134.33
138.14
129.03
128.80
平均0.762.132.20
P C R扩增成功率见图1,试剂盒法和改良C T A B法显示条带6条,成功率为100%,但试剂盒法显示条带弥散,S D S法显示条带4条,成功率为66.7%.就扩增成功率而言,改良C T A B法>试剂盒法>S D S法.综上对3种常用基因组D N A提取方法的比较可知,改良C T A B法提取的桔梗及其易混品的D N A含有少量R N A,质量浓度在150n g/μL,且P C R扩增成功率为100%,最适于桔梗及其易混品的D N A提取.
36
M.M a r k e r ;J .桔梗;N.南沙参;X.
霞草.图1 试剂盒法(a )㊁改良C T A B 法(b )㊁S D S 法(c )提取D N A
F i g .1 D N Ae x t r a c t i o nb y k
i tm e t h o d (a )㊁m o d i f i e dC T A Bm e t h o d (b )㊁S D Sm e t h o d (c )3.2 聚类分析和遗传距离计算
将28条I T S 序列构建N J 系统发育树,
见图2
.图2 基于I T S 序列的桔梗及易混品的N J 系统发育树(b o o t s t r a p 10
00次重复)F i g .2 N J o f P l a t y c o d o n g r a n d i f l o r u m a n dm i s c i b l e b a s e do n I T S s e q u e n c e (b o o t s t r a p 1000r e p
l i c a t e s )4
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第1期赵新悦等:中药材桔梗及其易混品的D N A 条形码分子鉴定
从图2可以看出:3种植物的I T S 序列分别聚为一支,
不同来源的桔梗样品聚为一个单系,支持率高达99.
但测序所得序列与下载序列未单独聚在一起,而是分别聚为一个分支.易混品南沙参与霞草均各自聚为一个单系,支持率分别为97和93,其中霞草为石竹科植物,与另外两者亲缘关系最远,南沙参与桔梗的亲缘关系较近.
将处理好的I T S 序列导入M E G A7.0软件,基于K i m u r a -2-p a r a m e t e r 模式计算种内种间遗传距离:所有样品之间的平均遗传距离为0.378,桔梗种内遗传距离为0.004,南沙参种内遗传距离为0.016,霞草种内遗传距离为0.007,桔梗与易混品南沙参之间的遗传距离为0.264,与霞草间的遗传距离为0.893.种内最大遗传距离均小于种间最小遗传距离,该结果与赵月梅等[14]研究结果一致,由此可见,基于I T S 基因序列的
D N A 条形码技术能够有效地鉴定桔梗及其易混品.3.3 特异性引物设计与鉴别
比对桔梗及其易混品霞草㊁南沙参的I T S 序列,查找在293位依次为G ㊁C ㊁A ,在538位为G ㊁T ㊁T ,
见图3.采用P r i m e rP r i m i e r5.0软件设计桔梗特异性引物U 1/D 1(U 1:5'G C T G T G A C C G C T C C T C G 3'
;D 1:5'C C T G T A T C C G C T C C A C C T G3'),并送至北京美吉桑格生物有限公司进行引物合成.使用此引物对上节所得D N A 模板进行扩增,结果见图4,发现仅桔梗可以特异性扩增出264b p 大小的条带.
图3 293位(a )和538位(b
)序列比对F i g .3 293p o s i t i o n (a )a n d 538p o s i t i o n (b )s e q u e n c e a l i g
n m e n
t M.M a r k e r ;J .桔梗;N.南沙参;X.霞草.图4 桔梗特异性引物鉴别结果
F i g .4 P l a t y c o d o n g r a n d i f l o r u m s p
e c i
f i c p r i m e r i d e n t i f i c a t i o n r e s u l t s 3.4 桔梗位点特异性P C R 方法建立
通过琼脂糖凝胶电泳显示条带的清晰明亮程度作为P C R 扩增效率的评判指标,见图5.退火温度在56ħ条件下桔梗扩增条带较为清晰;37~39个循环的扩增条带均清晰明亮,且程度相当;D N A 模板在50~400n g ,随着D N A 浓度增加,扩增条带由暗到亮到暗的过程,100n g 条件下桔梗扩增条带最为清晰且明亮;最适引物浓度考察时,引物在5.0μm o l /L 条件下,桔梗扩增条带最为清晰,且无非特异性扩增;P C R 特异性考察时,仅10批桔梗可扩增出特异性单一条带,其他样品均未扩增出特异性条带,从而验证此方法可以特异性地鉴别桔梗药材.优
5
6
化后的反应体系为:2ˑT a q P
C R M i x 需12.50μL ,正反向引物(5.0μm o l /L )各1.00μL ,模板(基因组
D N A 约0.1μg /μL )需2.00μL ,d d H 2O 补至25.00μL .P C R 反应条件:94ħ预变性5m i n 后,94ħ变性30s ,56ħ退火30s ,72ħ延伸45s ,37个循环后,72ħ延伸10m i n
.
M.M a r k e r ;J .桔梗;N.南沙参;X.
霞草.图5 退火温度(a )㊁循环次数(b )㊁D N A 模板量(c )和引物浓度优化(d )及特异性验证结果(e
)F i g .5 A n n e a l i n g t e m p e r a t u r e (a ),c y c l i n g n
u m b e r (b ),a m o u n t o f D N A (c )a n do p t i m i z e p r i m e r c o n c e n t r a t i o n (d ),s p e c i f i c i t y v
e r i
f i c a t i o n r e s u l t s (e )4 讨论
桔梗是中国常见的中药材之一,分布于东北㊁华北㊁华东㊁华中各省以及两广㊁云南㊁四川等地.朝鲜㊁日
本㊁苏联的远东和东西伯利亚地区的南部也有分布,范围较广.由于地理环境的差异,导致桔梗药材外观无法
6
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统一,质量也参差不齐,不仅使传统鉴别增加了难度,更是增加了易混品相互混淆的几率.目前市场上因外形无法区分的桔梗易混品主要是南沙参和霞草2个品种[16].三者在药效和药性上具有一定差异,药材的混用将直接影响到桔梗临床用药的安全和疗效.因此,对桔梗及其易混品进行深入的鉴定研究,对规范桔梗药材市场以及临床用药有重要意义.
植物D N A提取一般先后经历细胞壁和细胞膜裂解㊁蛋白质分离变性㊁核酸沉淀及D N A浓缩等多个步骤.桔梗药材在加工㊁贮藏过程中会造成D N A不同程度的降解,且自身含有的大量多糖,会与D N A结合形成黏稠的胶状物,使D N A难以溶解.本文通过比对3种提取方法,以D N A纯度㊁浓度和扩增成功率作为评价指标,得出改良C T A B法更适于桔梗及易混品的D N A提取,原因为C T A B是一种去污剂,可与核酸形成复合物,当降低溶液盐浓度到一定程度(<0.3m o l/LN a C l)时,复合物从溶液中沉淀,通过离心就可将C T A B与核酸的复合物同蛋白质㊁多糖类物质分开[17],可以有效防止桔梗多糖对D N A提取过程的干扰.基于I T S基因序列的D N A条形码技术能够有效地鉴定桔梗及其易混品,在此基础上,分析挖掘稳定的特异性位点,设计桔梗特异性鉴别引物,并对特异性P C R扩增条件进行优化,实现快速准确地鉴别桔梗及其易混品.
本文设计的桔梗特异性引物具有专属性强,重复性好,建立的方法操作简单,特异性强,耗时较短,无需测序,降低检测成本,只需通过琼脂糖凝胶电泳条带即可将正品桔梗与其易混品区分.本文建立了快速区分桔梗及其混伪品的分子鉴定方法,为桔梗D N A条形码技术研究进行补充与完善,并有望得到广泛的推广应用.
参考文献:
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(责任编辑:赵藏赏)。