酵母菌课程论文

酵母菌课程论文
酵母工程菌的构建过程及在食品中的应用
1.3.3食品级酵母表达系统的构建
酿酒酵母在食品_F业中的应用已有数千年历史，它也是最早发展起来用于表达异源蛋白的真核基因表达系统。

利用酿酒酵母表达系统已经成功的生产出了商品化的疫苗、重组酶等。

对酵母的分子生物学改造包括加强酵母对淀粉的利用、构建低双乙酞、低HZS和低高级醇的酵母工程菌、提高酵母絮凝性、增加啤酒泡沫稳定性、增加酵母发酵啤酒后的生香物质等。

然而，虽然酵母工程菌在现代食品工业中的应用越来越广一泛，关于_…程菌的安全性也越来越受到了消费者的质疑。

很多在实验室构建的酵母工程菌存在各种各样的安全和使用隐患，主要体现在酵母所使用的选择标记和酵母宿主本身两个方面。

酿酒酵母的选择标记主要有营养缺陷型和显性选择标记，但是这两种选择标记在食品发酵工业中的应用都各有缺陷。

使用营养缺陷性状标记需要先构建营养缺陷型单倍体酵母。

与多倍体工业菌株相比，单倍体酵母生长缓慢、难以高密度发酵、生长过程中性状不稳定容易发生突变和衰退，因此并不适合用来生产发酵食品或者发酵型饮料。

抗生素和重金属选择标记虽然适合工业酵母菌株，但是这两种选择标记都不安全，所以也不适合在食品工业中使用。

基于以上种种原因，构建食品级的酿酒酵母表达系统非常必要。

目前关于构建食品级酵母表达系统的研究相对较少。

Yapl基因是很多酵母基因组内相对保守的一种转录因子，属于激活保护酵母在压力下生长的基因，lwakiri等(2005)基于肠pl基因构建了假丝酵母食品级表达系
统。

使用来自假丝酵母本身的Yapl基因做为选择标记，将包含此标记的载体转入酵母后得到的转化子可以在含4林留ml以上浓度的放线菌酮的培养基上生长(lwakirietal2005)。

虽然Iwakiri所使用的选择标记是来自假丝酵母本身，但是由于在筛选时用了放线菌酮，因此也不能说是完全意义上的食品级选择标记。

要构建一种普适性的食品级基因…程表达系统，就必须找到一种在野生型食品级安全微生物中一般不存在、同时本身又安全且筛选简便的标记。

由于商业用的酿酒酵母几乎都无法利用蜜二糖(Liljestrom 一Suomineneza乙1988:Gasent一Ramirezeral.1995)，因此酿酒酵母对蜜二糖的发酵能力可以被用做食品级的筛选标记。

蜜二糖能够被a一半乳糖普酶 (EC32.1.22)分解为半乳糖和葡萄糖，含有a一半乳糖首酶的酵母阳性克隆能在以蜜二糖为唯一碳源的培养基上生长，且能够在含a一半乳糖普类寡糖类似物X一a一gal的平板上形成蓝色菌落，筛选非常简便。

为了提高从糖蜜产乙醇的产量或者以糖蜜为培养基生长的酵母的生物量，a一半乳糖营酶已经在很多的酿酒酵母中得到表达(Sehreuderelal.1993;Gasent一Ramirezelal.1995;Sehreuderezal.1996Shibuyaela乙1998;Shibuyaezaz，1999:ehiba.2az.2002)。

在酵母双杂交系统中a 一半乳糖首酶曾被用作选择标记(Melcherezal.2000)。

已经有以a一半乳糖首酶为筛选标记构建食品级Str印zocoeeusrherm即hilus和Lacroeoecuslaetl.s基因工程表达系统的报道(Boueherelal.2002;Jeongeral.2006;Labrieezal.2005)。

目前尚未见到
以a一半乳糖首酶为筛选标记构建食品级酵母表达系统的报道。

下面简单介绍一下a一半乳糖营酶的性质、特点和应用。

/doc/6ade8b0703d8ce2f00662358.ht ml 一半乳糖普酶的性质和特点
a一半乳糖营酶是一种外切酶，不同来源的a一半乳糖首酶分子量介于28kD一37k-D之间，有单聚体、二聚体、三聚体和四聚体四种存在形式。

根据可利用底物的特异性，a一半乳糖营酶可以被分为两类:一类能分解低分子量的a一半乳糖普比如PNPGal和如蜜二糖和棉籽糖等寡糖类底物;另一类主要是能特异性分解半乳甘露聚糖，并同时能不同程度水解低分子量的底物(shibuyaetal1998)。

a一半乳糖普酶的作用方式是断裂非还原性末端的a一D一半乳糖营键，产生一分子的a一半乳糖，但在90年代以来的研究表明，有些微生物的a一半乳糖
普酶还能水解其侧链基团是通过a一半乳糖普键连接的杂多糖。

a一半乳糖普酶是一种糖基化酶，其蛋白质和糖普的连接方式是通过低聚糖中的乙酞葡萄糖胺和蛋白质中的天冬氨酸相连接。

酵母a一半乳糖营酶的多肚链上有9个左右的糖基化位点
(Liljestrom一Suominenetal.1988)，正确的糖基化对维持a一半乳糖普酶的活性与稳定性及其对a一半乳糖普特异底物的亲和性具有非常重要的作用。

微生物合成的a一半乳糖营酶皆为诱导酶，一般的诱导物是酶作用的底物或底物类似物，如蜜二糖、棉籽糖和X一a一ga!等，有时还可能是a一半乳糖营的分解产物如半乳糖(李孝辉等，2002)。

不同来源的a一半乳糖营酶最适pH和最适温度不同。

一般细菌的a一半乳糖营酶最适pH在
6.5一
7.5之间，最适温度在37oC一400C之间;许多真菌如Corrieiumro11(KajiandYoshihara1972)和A护e馆illus”iger(A demarketal.2001;刘彩琴等，2006)产的a一半乳糖营酶的最适pH 为2.5一5.0，最适温度在sooC一600C之I旬。

而来自丑acillusstearolherm叩hilus、Thermotoga(Millereral.2001)和The，us胡产的a一半乳糖营酶在70oC以上也很稳定，Thermoanaerobaeterium 尸 olrsaeeharolytieum(Kingeral.2002)产的a一半乳糖普酶酶可在70℃稳定存在36h。

酵母属中Saeeharo叩cesvar.uvarum，SaeeharoZn.Fcesvar.earlsbe 狠ensis和Saceharon移pcesoleaginosus可以分泌a一半乳糖营酶了几企0。

5.ilalicusvat.Mezibiosi染色体上中至少有3一6个Mel基因，而Saeeha厂。

，即cesvar.earlsbe塔ensl’s大概有1一2个Mel 基因(RiehardandBruee1951)。

Naumov(1990)通过基因杂交分析发现酿酒酵母Me厂菌株染色体上的a一半乳糖营酶基因有7个 (Gennadi。

tal1990)。

酿酒酵母分泌的a一半乳糖营酶属于GAL基因家族，受蜜二糖、棉籽糖的诱导和葡萄糖的抑制，其启动子序列里有一个能和
GAL4相结合的UASG位点。

在非抑制培养基如甘油和乳酸培养基中。

一半乳糖首酶也会有低水平的组成型表达。

saccharomyce:var.uvar训2来源的a一半乳糖首酶分子量为76KD，去糖基化处理后减少为56kD爪uoholaetal.1986)，其N端存在一个由18个氨基酸组成的信号肚。

1.3.3.2a一半乳糖昔酶的重组表达
不同来源的a一半乳糖营酶已经在酵母中得到表达。

来自瓜尔豆类的
a一半乳糖营酶基因在GAL7启动子和蔗糖酶信号肤的控制下在酿酒酵母中的表达量能达到28.6m吮细胞干重;在多形汉逊酵母中由于采用了甲醇诱导启动子，a一半乳糖首酶的表达量能达到42m眺细胞干重(GiusePpinetal1993)。

使用来自乳酸克鲁维亚酵母的rDNA序列，Be嗯kamp成功地将来自仰am叩515rerr叮onoloba的a一半乳糖普酶基因多拷贝整合到乳酸克鲁维酵母染色体中，并获得高水平的表达(250m酬)(Be 嗯kampezal1992)。

LIljestrom一suominen(1988)构建了一株能够稳定表达a一半乳糖营酶的商业用酿酒酵母菌株Strain1ZE一2(Liljestrom一suominen.Z.21985)，发现与天然产酶菌株相比，转化菌株的a一半乳糖首酶表达量要高出6倍。

张学文等口006)从酿酒酵母AH109中分离克隆a一半乳糖营酶的编码基因Me月，利用组成型启动子pGAP构建pGAPZa一Mell表达载体，转化毕赤酵母实现了Q一半乳糖首酶在毕赤酵母内的组成型表达，但是所产酶活较低(张学文等，2006)。

来自penicil ll’um purPurogenum的a一半乳糖营酶基因在GAL]启动子的控制下在酿酒酵母中得到高水平表达(0.2g/l)，且酶学性质没有改变(Shibuyaetal.1998)。

a一半乳糖营酶在细菌中也得到了表达，但是在细菌中表达的a一半乳糖营酶大部分以包涵体形式存在，必须破碎细胞才有活性，且酶活很低并缺乏糖基化修饰。

尽管a一半乳糖昔酶在酵母得到广泛表达，但一般表达量偏低且缺乏实际的应用。

1.3.3.3a一半乳糖昔酶的应用
1)a一半乳糖普酶能水解大豆和豆粕中的抗营养因子棉籽糖、水苏
塘等不能被人消化吸收的低聚糖类，消除大豆中的胀气因子，增加豆类食品和饲料的营养价值，提高畜禽的生产性能。

2)a一半乳糖普酶能降低小扁豆和豌豆中的胃肠胀气因子，在甜菜加工工业中，棉籽糖的存在不利于蔗糖结晶的产生，用a一半乳糖营酶降解棉籽糖，可以提高蔗糖的产率。

3)刺槐豆树胶、纠尔豆胶这两中树胶都含有以。

一D一l，4一甘露聚糖为骨架的杂多糖。

纠尔豆胶含38%一40%的a一半乳糖，洋槐豆胶则含有22%一24%的价半乳糖。

它们均通过半乳糖残基连接到以甘露糖为主链的甘露聚糖上。

a一半乳糖基侧链的多少及位臵，决定其在水中的溶解度和凝胶能力。

纠尔豆胶与刺槐胶相比，其胶凝能力不如刺槐胶，如用a 一半乳糖首酶来进行适当处理，进行改性除去适量侧链的半乳糖残基而不使甘露聚糖主链断裂，可极大地提高纠尔豆胶的胶凝能力。

4)通过a一半乳糖营酶的转糖基反应可以合成新的寡糖类双歧因子。

5)a一半乳糖营酶可用来水解纸浆及造纸工业中木材的植物细胞壁，因为构成细胞壁的半纤维素主要由半乳甘露聚糖和葡甘露聚糖组成。

6)a一半乳糖普酶可应用在人B一。

血型改造、清除异种抗原以及治疗遗传性疾病法布莱氏病等方面。

O型血在接受B型血细胞时会产生抗体，这样在异体输血时易造成致命的溶血反应。

而O型血与B型血.相比仅少了一个末端a一D一半乳糖残基，用a一半乳糖首酶可将B型血转化为O 型血，增加了“通用”血型的储备。

7)外源性补充a一半乳糖营酶可治疗因缺乏a一半乳糖营酶A(a一
GalA)致使糖鞘脂成分如神经酞胺三己糖营(CTH)或globotriaosylee一ramide(Gb3)、二乳糖营神经酞胺等堆积于中枢神经系统神经元造成的Fabry病(弥漫性体血.管角质瘤)。