病毒的纯化和检测.ppt
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• 病毒感染细胞的结果可使培养液的pH值 改变，说明细胞的代谢在病毒感染后发生 了变化。这种培养环境的生化改变也可作 为判断病毒增殖的指标。
(二) 病毒的数量与感染性测定
• 1.蚀斑测定
• 是一种检查和准确滴定病毒感染性的方法。 将稀释的病毒悬液加入单层细胞培养瓶中。 病毒吸附后，再覆盖一层融化的半固体营养 琼脂，使病毒在单层细胞培养中有限扩散。 结果是每一个有感染性的病毒在单层细胞中 可产生一个局限性的感染灶。用活性染料 (如 中性红) 染色，则活细胞着色，受病毒感染而 破坏的细胞不着色，形成肉眼可见的蚀斑 (plaque)。每个蚀斑是由一个感染性病毒颗 粒形成的，称作蚀斑形成单位 (plaque forming unit,PFU)。病毒悬液中的感染性 病毒量的滴度可用PFU／ml表示。
• 病毒的纯化可以应用提纯蛋白质的技术方 法；
• 对大小、形状和密度高度一致的病毒粒子， 可以采用分级分离的技术。
四、病毒萃取液的分级纯化
• 沉淀法 ➢中性盐沉淀法
➢聚乙二醇沉淀法
➢有机溶剂沉淀法 ➢等电点沉淀法
• 离心法
➢差速离心法 ➢密度梯度离心法
速率区带离心法 等密度区带法
➢凝胶色谱法 ➢电泳法
生产较复杂、成本高
生产简单、成本低
二、人工被动免疫
• 人工被动免疫的制剂有免疫血清和丙种球蛋白， 或与细胞免疫有关的因子等。大多数人均受过不 同种类的病毒感染，从正常血清中提取免疫球蛋 白可用于紧急预防。常注射人免疫球蛋白预防甲 型肝炎、麻疹、脊髓灰质炎等。可使接触病原者 不出现症状或仅出现轻微症状。近年来有人应用 含有高滴度抗HBs的乙肝免疫球蛋白Ig) 预防乙型 肝炎有一定效果。在使用免疫球蛋白时因其半衰 期短，故应注意有效期。
病毒感染的纯化与诊断
第一节 病毒的纯化
一、病毒纯化前的准备工作 繁殖病毒 利用生物学方法纯化病毒
二、标本的采取与送检
• 应注意下列原则：
• 1.对本身带有杂菌 (如咽拭子、粪便) 或易 受污染的标本，要进行病毒分离培养时， 应使用抗生素。
• 2.因病毒在室温中易失去活性，标本应低 温保存并尽快送检。
前有过隐性感染所致。因此，中和试验适用于
人群免疫情况的调查，在临床诊断上较少使用。
3.补体结合试验 (complement fixation
test,CF test)
• 如果反应系统中存在待测的抗体（或抗原）， 则抗原抗体发生反应后可结合补体；再加入指 示系统时，由于反应液中已没有游离的补体而 不出现溶血，是为补体结合试验阳性。如果反 应系统中不存在的待检的抗体（或抗原），则 在液体中仍有游离的补体存在，当加入指示系 统时会出现溶血，是为补体结合试验阴性。因 此补体结合试验可用已知抗原来检测相应抗体， 或用已知抗体来检测相应抗原。
大规模或有序排布于小块硅片等载体上，与待测 样品中的生物分子或基因序列相互作用和并行反 应，在激光的激发下，产生的荧光谱信号被接受 器收集，计算机自动分析处理数据并报告结果。 其优点是：可以一次性完成大量样品DNA序列的 检测和分析，解决了传统核酸杂交技术的许多不 足。芯片技术在病毒等微生物学诊断和流行病学 调查方面有着广阔的应用前景。
四、病毒核酸检测
杂交法 用于病毒检测的有斑点杂交、 细胞内原位杂交 、DNA印迹杂交、RNA 印迹杂交等。
PCR法 目前多数病毒基因已通过分子克 隆技术被明确了核苷酸序列，使得DNA 扩增技术逐步发展为常规诊断技术之一。
反转录PCR
基因芯片技术
• 又称DNA芯片、生物芯片（biochip）。 • 其原理是：将已知的生物分子探针或基因探针，
• 根据检测目的和操作步骤不同，有竞争法、双 抗体夹心法、间接法三种类型的常用方法。
竞争法
此法可用于抗原和半抗原的定量测定，也可用于测定抗 体。以测定抗原为例, 将抗原吸附于固相载体；加入待 测抗原和一定量特异性抗体，使固相抗原与待测抗原 二者竞争与抗体结合；经过洗涤分离，最后结合于固 相的抗体与待测抗原含量呈负相关。
Plaque f (TCID50)测定法
该方法是测定病毒能使50%的组织培养细 胞发生感染的最小量。一般是将病毒悬 液作10倍的系列稀释，分别接种细胞， 经一定时间后观察CPE、血细胞吸附等 指标，以最高稀释度能感染50%细胞的 量为终点。最后用统计方法计算出50% 组织细胞感染量。
因为病毒粒子对细菌细胞感染率不会超过100％，所 以根据噬菌斑或空斑计算出的病毒粒子数总比噬菌 体电镜下观察数低。
• 半致死剂量(LD50) ： 使半数宿主细胞死亡 的病毒剂量称半致死剂量；
• 半致感染剂量(ID50) ：使半数宿主细胞发 生感染的病毒剂量 ；
• 半数组织培养感染剂量(TCID50) ：使半数 组织培养物发生感染，产生细胞病变效应 的病毒剂量。
二、病毒的培养
• 1.动物接种 • 是最原始的病毒培养方法，根据病毒
种类不同，选择敏感动物及适宜接种部 位，如嗜神经性病毒（狂犬病毒）可接 种于小鼠脑内，痘病毒可接种于家兔角 膜或皮内。
• 2.鸡胚培养
• 鸡胚对多种病毒敏感。一般采用孵化9～ 14天的鸡胚，根据病毒种类不同，将病毒 标本接种于鸡胚的不同部位，最常用的鸡 胚接种部位有：羊膜腔、尿囊腔、绒毛尿 囊膜和卵黄囊等。
双抗体夹心法
此法常用于测定抗原, 将已知抗体吸附于固相载 体, 加入待检标本(含相应抗原)与之结合。温 育后洗涤，加入酶标抗体和底物进行测定。
间接法
此法是测定抗体最常用的方法。将已知抗原吸附 于固相载体，加入待检标本(含相应抗体)与之 结合。洗涤后，加入酶标抗球蛋白抗体(酶标 抗抗体)和底物进行测定。
• 3.干扰现象(interference)
• 某些病毒感染细胞时不出现CPE或其他易 于测出的变化(如HAd)，但能干扰在其后感 染的另一病毒的增殖。如风疹病毒感染 Vero细胞时CPE不明显，但它能干扰后感 染的埃可病毒 (ECHOV) 的增殖，从而阻抑 后者所特有的CPE。
• 4.细胞代谢的改变
• 6.新型多价联合疫苗、口服疫苗的研究
减毒活疫苗与死疫苗优缺点比较
特点
减毒活疫苗
死疫苗
制备方法 免疫接种
通过非正常培养减毒株 一般为一次性
通过化学物理方法使感 染失活
多次免疫
疫苗的稳定性
相对不稳定
相对稳定
免疫的类型
体液免疫和细胞免疫
体液免疫
毒力回升
有可能
不可能
安全性
对免疫缺陷者有危险
安全性好
生产和成本
• 1.无环鸟苷 (acyclovir,ACV，阿昔洛韦)和丙 氧鸟苷（ganciclovir GCV，庚昔洛韦）为 鸟嘌呤或脱氧鸟嘌呤核苷类似物。 该药细
• 3.血清学诊断标本的采取应在发病初期和 病后各取血清，以便对比双份血清抗体效 价的动态变化。
三、病毒和病毒成份的提纯
• 病毒纯度的判定依据：
➢物理均一性； ➢病毒滴度与蛋白含量的比例； ➢免疫反应单一而无非特异反应； ➢结晶形成
• 病毒提纯的主要原则：
• 在病毒不失活的前提下，从宿主细胞中释 放出来；
第二节 病毒感染的预防
• 一、人工自动免疫 • (一)活疫苗(attenuated vaccine,or living
vaccine) • 1.常规活疫苗即减毒活疫苗(attenuated
vaccine)，通常是用自然或人工选择法(如 温度敏感株) 筛选的对人低毒或无毒的变异 株制成的疫苗，如脊髓灰质炎、流感、麻 疹的减毒活疫苗等。
第三节 病毒感染的治疗
• 一、抗病化学制剂 • （一）核苷类药物 • 核苷类药物的作用机制有主要是抑制病毒基因
复制①模拟核苷成分掺入病毒基因组：合成的异 常嘧啶取代病毒DNA前体的胸腺嘧啶，病毒在复 制过程中，这种异常的嘧啶分子掺入子代DNA中 使子代病毒结构基因的合成和表达无法进行，从 而抑制病毒的复制，或复制出的病毒为缺陷病毒。 ②竞争病毒复制酶
第二节 病毒的检测
一、侵染力的测定
• 病毒的感染单位（IU）：能够引起宿主或宿主细 胞发生一定特异性反应的病毒最小剂量；
• 病毒效价：指单位体积(ml)病毒悬液的感染单位 数目(IU／ml)或称毒力 ；
• 噬菌体效价（pfu) ：又称噬菌斑形成单位数指单 位体积的噬菌体，能使感染细菌裂解，产生噬菌 斑的数量。
• 3.组织培养法 (tissueculture) 或细胞培养 (cellculture)法
• 是将离体活组织块或分散的组织细胞加以 培养的技术总称，为病毒分离鉴定中的最 常用的基本方法。
病毒在培养细胞中增殖的指标
1. 细胞的变化
① 有些病毒在细胞内增殖时可引起特有的细胞病变， 称为细胞病变效应 (CPE)。常见的变化有细胞变圆、 聚集、坏死、溶解或脱落等。
补体结合试验图示
受检系统
指示系统
1、仅有抗原或抗体
红
细
补
胞
抗原/抗体
体
溶血素
溶血反应 阳性
2、抗原抗体反应
抗原 补 体
抗体
红细胞 溶血素
阴性
补体结合试验 阴性
阳性
4.凝胶扩散法
• Ag和Ab
5. 酶联免疫吸附测定法（enzymelinked immunosorbent assay 简称 ELISA ）
• 4.基因工程疫苗(geneenginering vaccine)利用基 因工程技术，分离、重组、转化和表达基因，制 备出的能引起人体保护性免疫应答疫苗。
• 5. DNA疫苗 又称基因疫苗或核酸疫苗，这种核酸 分子是一种细菌的质粒，在克隆了特异性的基因 以后，能在真核细胞中表达蛋白质抗原，刺激机 体产生特异性体液和细胞免疫 。
2.中和试验(neutralizing test,NT test)
• 是病毒在活体内或细胞培养中被特异性抗体中 和而失去感染性的一种试验。
•
中和抗体是作用于病毒表面抗原 (衣壳或
包膜) 的抗体，同种不同型病毒间一般无交叉，
特异性高，而且抗体在体内维持时间长。中和
抗体阳性不一定表示正在感染中，也可能因以
以待测抗原（或抗体）与酶标抗体（或抗原） 的特异结合反应为基础，通过酶活力测定 来确定抗原（或抗体）含量。
ELISA的基本类型
• 先将已知的抗体或抗原结合在某种固相裁体上， 并保持其免疫活性。测定时，将待检标本和酶 标抗原或抗体按不同步骤与固相载体表面吸附 的抗体或抗原发生反应。用洗涤的方法分离抗 原抗体复合物和游离成分。然后加入酶的作用 底物催化显色，进行定性或定量测定。
• 2.新型活疫苗 应用基因工程技术，控制病 毒变异，或利用DNA重组技术，插入和定 向缺失病毒基因，将保护性病毒蛋白的编 码基因插入活载体中或选择性地去除病毒 的某一个或几个致病基因而达到减毒作用 制备的可在机体内增殖，诱发抗病毒免疫 应答的疫苗。
(二)死疫苗(killed vaccine)
• 1.灭活全病毒疫苗 应用物理或化学方法使病毒完 全灭活而制成的疫苗。常用的有乙型脑炎、狂犬 病、流感等灭活疫苗。
② 有些病毒如麻疹病毒、CMV、RSV等 作用于细胞膜， 可使邻近的细胞相互融合，形成多核巨细胞或称融 合细胞。
③ 有些病毒 (如狂犬病病毒、麻疹病毒等) 可在培养 细胞中形成胞浆或核内的包涵体。
病毒培养时出现的CPE
• 2.红细胞吸附 (hemadsorption,HAd)
• 流感或副流感病毒等感染细胞后，由于细胞膜 上出现了血凝素(haemagglutinin,HA)，具有吸 附脊椎动物 (豚鼠、鸡、猴等) 红细胞的能力，这 一现象称红细胞吸附，常用来测定具有HA的粘病 毒与副粘病毒的增殖。若有相应的抗血清，则能 中和细胞膜上的HA，HAd不再发生，称红细胞吸 附抑制试验。
• 2.亚单位疫苗(subunit vaccine)制备不含有病毒核 酸、仅含有能诱发中和抗体的病毒衣壳蛋白或包 膜表面抗原，是最理想的疫苗。
• 3.合成肽病毒疫苗(synthesized peptide viral vaccine)人工合成与病毒保护性抗原决定簇的氨 基酸序列相同的肽段，制备成免疫原后免疫动物 或人体，使机体产生保护性抗体
三、病毒感染的血清学诊断
•
原理是用已知病毒抗原来检测病人血
清中有无相应抗体，故须待病人感染后体
内产生抗体时才能检出。
•
另外，在采取临床标本及病人血清应
注意病程，必须采取患者急性期血清与恢
复期血清 (双份血清) 进行血清学试验。若
第2次血清抗体滴度比第1次高出4倍以上时，
1.免疫沉淀法
使Ag-Ab形成不溶性的沉淀。
(二) 病毒的数量与感染性测定
• 1.蚀斑测定
• 是一种检查和准确滴定病毒感染性的方法。 将稀释的病毒悬液加入单层细胞培养瓶中。 病毒吸附后，再覆盖一层融化的半固体营养 琼脂，使病毒在单层细胞培养中有限扩散。 结果是每一个有感染性的病毒在单层细胞中 可产生一个局限性的感染灶。用活性染料 (如 中性红) 染色，则活细胞着色，受病毒感染而 破坏的细胞不着色，形成肉眼可见的蚀斑 (plaque)。每个蚀斑是由一个感染性病毒颗 粒形成的，称作蚀斑形成单位 (plaque forming unit,PFU)。病毒悬液中的感染性 病毒量的滴度可用PFU／ml表示。
• 病毒的纯化可以应用提纯蛋白质的技术方 法；
• 对大小、形状和密度高度一致的病毒粒子， 可以采用分级分离的技术。
四、病毒萃取液的分级纯化
• 沉淀法 ➢中性盐沉淀法
➢聚乙二醇沉淀法
➢有机溶剂沉淀法 ➢等电点沉淀法
• 离心法
➢差速离心法 ➢密度梯度离心法
速率区带离心法 等密度区带法
➢凝胶色谱法 ➢电泳法
生产较复杂、成本高
生产简单、成本低
二、人工被动免疫
• 人工被动免疫的制剂有免疫血清和丙种球蛋白， 或与细胞免疫有关的因子等。大多数人均受过不 同种类的病毒感染，从正常血清中提取免疫球蛋 白可用于紧急预防。常注射人免疫球蛋白预防甲 型肝炎、麻疹、脊髓灰质炎等。可使接触病原者 不出现症状或仅出现轻微症状。近年来有人应用 含有高滴度抗HBs的乙肝免疫球蛋白Ig) 预防乙型 肝炎有一定效果。在使用免疫球蛋白时因其半衰 期短，故应注意有效期。
病毒感染的纯化与诊断
第一节 病毒的纯化
一、病毒纯化前的准备工作 繁殖病毒 利用生物学方法纯化病毒
二、标本的采取与送检
• 应注意下列原则：
• 1.对本身带有杂菌 (如咽拭子、粪便) 或易 受污染的标本，要进行病毒分离培养时， 应使用抗生素。
• 2.因病毒在室温中易失去活性，标本应低 温保存并尽快送检。
前有过隐性感染所致。因此，中和试验适用于
人群免疫情况的调查，在临床诊断上较少使用。
3.补体结合试验 (complement fixation
test,CF test)
• 如果反应系统中存在待测的抗体（或抗原）， 则抗原抗体发生反应后可结合补体；再加入指 示系统时，由于反应液中已没有游离的补体而 不出现溶血，是为补体结合试验阳性。如果反 应系统中不存在的待检的抗体（或抗原），则 在液体中仍有游离的补体存在，当加入指示系 统时会出现溶血，是为补体结合试验阴性。因 此补体结合试验可用已知抗原来检测相应抗体， 或用已知抗体来检测相应抗原。
大规模或有序排布于小块硅片等载体上，与待测 样品中的生物分子或基因序列相互作用和并行反 应，在激光的激发下，产生的荧光谱信号被接受 器收集，计算机自动分析处理数据并报告结果。 其优点是：可以一次性完成大量样品DNA序列的 检测和分析，解决了传统核酸杂交技术的许多不 足。芯片技术在病毒等微生物学诊断和流行病学 调查方面有着广阔的应用前景。
四、病毒核酸检测
杂交法 用于病毒检测的有斑点杂交、 细胞内原位杂交 、DNA印迹杂交、RNA 印迹杂交等。
PCR法 目前多数病毒基因已通过分子克 隆技术被明确了核苷酸序列，使得DNA 扩增技术逐步发展为常规诊断技术之一。
反转录PCR
基因芯片技术
• 又称DNA芯片、生物芯片（biochip）。 • 其原理是：将已知的生物分子探针或基因探针，
• 根据检测目的和操作步骤不同，有竞争法、双 抗体夹心法、间接法三种类型的常用方法。
竞争法
此法可用于抗原和半抗原的定量测定，也可用于测定抗 体。以测定抗原为例, 将抗原吸附于固相载体；加入待 测抗原和一定量特异性抗体，使固相抗原与待测抗原 二者竞争与抗体结合；经过洗涤分离，最后结合于固 相的抗体与待测抗原含量呈负相关。
Plaque f (TCID50)测定法
该方法是测定病毒能使50%的组织培养细 胞发生感染的最小量。一般是将病毒悬 液作10倍的系列稀释，分别接种细胞， 经一定时间后观察CPE、血细胞吸附等 指标，以最高稀释度能感染50%细胞的 量为终点。最后用统计方法计算出50% 组织细胞感染量。
因为病毒粒子对细菌细胞感染率不会超过100％，所 以根据噬菌斑或空斑计算出的病毒粒子数总比噬菌 体电镜下观察数低。
• 半致死剂量(LD50) ： 使半数宿主细胞死亡 的病毒剂量称半致死剂量；
• 半致感染剂量(ID50) ：使半数宿主细胞发 生感染的病毒剂量 ；
• 半数组织培养感染剂量(TCID50) ：使半数 组织培养物发生感染，产生细胞病变效应 的病毒剂量。
二、病毒的培养
• 1.动物接种 • 是最原始的病毒培养方法，根据病毒
种类不同，选择敏感动物及适宜接种部 位，如嗜神经性病毒（狂犬病毒）可接 种于小鼠脑内，痘病毒可接种于家兔角 膜或皮内。
• 2.鸡胚培养
• 鸡胚对多种病毒敏感。一般采用孵化9～ 14天的鸡胚，根据病毒种类不同，将病毒 标本接种于鸡胚的不同部位，最常用的鸡 胚接种部位有：羊膜腔、尿囊腔、绒毛尿 囊膜和卵黄囊等。
双抗体夹心法
此法常用于测定抗原, 将已知抗体吸附于固相载 体, 加入待检标本(含相应抗原)与之结合。温 育后洗涤，加入酶标抗体和底物进行测定。
间接法
此法是测定抗体最常用的方法。将已知抗原吸附 于固相载体，加入待检标本(含相应抗体)与之 结合。洗涤后，加入酶标抗球蛋白抗体(酶标 抗抗体)和底物进行测定。
• 3.干扰现象(interference)
• 某些病毒感染细胞时不出现CPE或其他易 于测出的变化(如HAd)，但能干扰在其后感 染的另一病毒的增殖。如风疹病毒感染 Vero细胞时CPE不明显，但它能干扰后感 染的埃可病毒 (ECHOV) 的增殖，从而阻抑 后者所特有的CPE。
• 4.细胞代谢的改变
• 6.新型多价联合疫苗、口服疫苗的研究
减毒活疫苗与死疫苗优缺点比较
特点
减毒活疫苗
死疫苗
制备方法 免疫接种
通过非正常培养减毒株 一般为一次性
通过化学物理方法使感 染失活
多次免疫
疫苗的稳定性
相对不稳定
相对稳定
免疫的类型
体液免疫和细胞免疫
体液免疫
毒力回升
有可能
不可能
安全性
对免疫缺陷者有危险
安全性好
生产和成本
• 1.无环鸟苷 (acyclovir,ACV，阿昔洛韦)和丙 氧鸟苷（ganciclovir GCV，庚昔洛韦）为 鸟嘌呤或脱氧鸟嘌呤核苷类似物。 该药细
• 3.血清学诊断标本的采取应在发病初期和 病后各取血清，以便对比双份血清抗体效 价的动态变化。
三、病毒和病毒成份的提纯
• 病毒纯度的判定依据：
➢物理均一性； ➢病毒滴度与蛋白含量的比例； ➢免疫反应单一而无非特异反应； ➢结晶形成
• 病毒提纯的主要原则：
• 在病毒不失活的前提下，从宿主细胞中释 放出来；
第二节 病毒感染的预防
• 一、人工自动免疫 • (一)活疫苗(attenuated vaccine,or living
vaccine) • 1.常规活疫苗即减毒活疫苗(attenuated
vaccine)，通常是用自然或人工选择法(如 温度敏感株) 筛选的对人低毒或无毒的变异 株制成的疫苗，如脊髓灰质炎、流感、麻 疹的减毒活疫苗等。
第三节 病毒感染的治疗
• 一、抗病化学制剂 • （一）核苷类药物 • 核苷类药物的作用机制有主要是抑制病毒基因
复制①模拟核苷成分掺入病毒基因组：合成的异 常嘧啶取代病毒DNA前体的胸腺嘧啶，病毒在复 制过程中，这种异常的嘧啶分子掺入子代DNA中 使子代病毒结构基因的合成和表达无法进行，从 而抑制病毒的复制，或复制出的病毒为缺陷病毒。 ②竞争病毒复制酶
第二节 病毒的检测
一、侵染力的测定
• 病毒的感染单位（IU）：能够引起宿主或宿主细 胞发生一定特异性反应的病毒最小剂量；
• 病毒效价：指单位体积(ml)病毒悬液的感染单位 数目(IU／ml)或称毒力 ；
• 噬菌体效价（pfu) ：又称噬菌斑形成单位数指单 位体积的噬菌体，能使感染细菌裂解，产生噬菌 斑的数量。
• 3.组织培养法 (tissueculture) 或细胞培养 (cellculture)法
• 是将离体活组织块或分散的组织细胞加以 培养的技术总称，为病毒分离鉴定中的最 常用的基本方法。
病毒在培养细胞中增殖的指标
1. 细胞的变化
① 有些病毒在细胞内增殖时可引起特有的细胞病变， 称为细胞病变效应 (CPE)。常见的变化有细胞变圆、 聚集、坏死、溶解或脱落等。
补体结合试验图示
受检系统
指示系统
1、仅有抗原或抗体
红
细
补
胞
抗原/抗体
体
溶血素
溶血反应 阳性
2、抗原抗体反应
抗原 补 体
抗体
红细胞 溶血素
阴性
补体结合试验 阴性
阳性
4.凝胶扩散法
• Ag和Ab
5. 酶联免疫吸附测定法（enzymelinked immunosorbent assay 简称 ELISA ）
• 4.基因工程疫苗(geneenginering vaccine)利用基 因工程技术，分离、重组、转化和表达基因，制 备出的能引起人体保护性免疫应答疫苗。
• 5. DNA疫苗 又称基因疫苗或核酸疫苗，这种核酸 分子是一种细菌的质粒，在克隆了特异性的基因 以后，能在真核细胞中表达蛋白质抗原，刺激机 体产生特异性体液和细胞免疫 。
2.中和试验(neutralizing test,NT test)
• 是病毒在活体内或细胞培养中被特异性抗体中 和而失去感染性的一种试验。
•
中和抗体是作用于病毒表面抗原 (衣壳或
包膜) 的抗体，同种不同型病毒间一般无交叉，
特异性高，而且抗体在体内维持时间长。中和
抗体阳性不一定表示正在感染中，也可能因以
以待测抗原（或抗体）与酶标抗体（或抗原） 的特异结合反应为基础，通过酶活力测定 来确定抗原（或抗体）含量。
ELISA的基本类型
• 先将已知的抗体或抗原结合在某种固相裁体上， 并保持其免疫活性。测定时，将待检标本和酶 标抗原或抗体按不同步骤与固相载体表面吸附 的抗体或抗原发生反应。用洗涤的方法分离抗 原抗体复合物和游离成分。然后加入酶的作用 底物催化显色，进行定性或定量测定。
• 2.新型活疫苗 应用基因工程技术，控制病 毒变异，或利用DNA重组技术，插入和定 向缺失病毒基因，将保护性病毒蛋白的编 码基因插入活载体中或选择性地去除病毒 的某一个或几个致病基因而达到减毒作用 制备的可在机体内增殖，诱发抗病毒免疫 应答的疫苗。
(二)死疫苗(killed vaccine)
• 1.灭活全病毒疫苗 应用物理或化学方法使病毒完 全灭活而制成的疫苗。常用的有乙型脑炎、狂犬 病、流感等灭活疫苗。
② 有些病毒如麻疹病毒、CMV、RSV等 作用于细胞膜， 可使邻近的细胞相互融合，形成多核巨细胞或称融 合细胞。
③ 有些病毒 (如狂犬病病毒、麻疹病毒等) 可在培养 细胞中形成胞浆或核内的包涵体。
病毒培养时出现的CPE
• 2.红细胞吸附 (hemadsorption,HAd)
• 流感或副流感病毒等感染细胞后，由于细胞膜 上出现了血凝素(haemagglutinin,HA)，具有吸 附脊椎动物 (豚鼠、鸡、猴等) 红细胞的能力，这 一现象称红细胞吸附，常用来测定具有HA的粘病 毒与副粘病毒的增殖。若有相应的抗血清，则能 中和细胞膜上的HA，HAd不再发生，称红细胞吸 附抑制试验。
• 2.亚单位疫苗(subunit vaccine)制备不含有病毒核 酸、仅含有能诱发中和抗体的病毒衣壳蛋白或包 膜表面抗原，是最理想的疫苗。
• 3.合成肽病毒疫苗(synthesized peptide viral vaccine)人工合成与病毒保护性抗原决定簇的氨 基酸序列相同的肽段，制备成免疫原后免疫动物 或人体，使机体产生保护性抗体
三、病毒感染的血清学诊断
•
原理是用已知病毒抗原来检测病人血
清中有无相应抗体，故须待病人感染后体
内产生抗体时才能检出。
•
另外，在采取临床标本及病人血清应
注意病程，必须采取患者急性期血清与恢
复期血清 (双份血清) 进行血清学试验。若
第2次血清抗体滴度比第1次高出4倍以上时，
1.免疫沉淀法
使Ag-Ab形成不溶性的沉淀。