第九章 工业发酵染菌的分析与控制

原因：通气不良或停止搅拌导致溶解氧浓度不 足；原料质量差或灭菌效果差导致培养基质量 下降；接种的孢子或菌丝保藏时间长而菌落数 少，泡沫多；罐内装料小、菌丝粘壁等会导致 培养液的菌丝浓度比较低；此外接种物种龄短 等。
(3)代谢不正常 糖、氨基氮等变化不正常，菌体浓度 和代谢产物不正常。 原因：与接种物质量和培养基质量差有关， 还与培养环境条件差、接种量小、杂菌污 染等有关。
二、不同种类的杂菌对发酵的影响
青霉素发酵： 杂菌产生青霉素酶会迅速分解破坏青霉素。 污染细短产气杆菌比粗大杆菌的危害大 链霉素发酵： 污染细短杆菌、假单孢杆菌和产气杆菌比粗大 杆菌的危害大。 四环素发酵： 污染双球菌、芽孢杆菌和夹膜杆菌的危害较大
柠檬酸发酵： 最怕污染青霉菌 肌苷、肌苷酸发酵： 污染芽孢杆菌的危害最大 谷氨酸发酵： 最怕污染噬菌体 高温淀粉酶发酵： 污染芽孢杆菌和噬菌体的危害较大
四、不同染菌途径对发酵的影响
种子带菌： 种子带菌可使发酵染菌具有延续性 空气带菌： 空气带菌也使发酵染菌具有延续性，导 致染菌范围扩大至所有发酵罐 培养基或设备灭菌不彻底： 一般为孤立事件，不具有延续性 设备渗漏： 这种途径造成染菌的危害性较大
五．染菌对产物提取和 产品质量的影响
1．对过滤的影响 发酵液的黏度加大；菌体大多自溶；由 于发酵不彻底，基质的残留浓度加度。 造成过滤时间拉长，影响设备的周转使 用，破坏生产平衡； 大幅度降低过滤收率。
第九章 工业发酵染菌的分析与控制
第一节 发酵染菌的危害
发酵染菌能给生产带来严重危害，防止杂菌污 染是任何发酵工厂的一项重要工作内容。尤其是无 菌程度要求高的液体深层发酵，污染防止工作的重 要性更为突出。 所谓“杂菌”， 是指在发酵培养中侵入了有 碍生产的其他微生物。
几乎所有的发酵工业，都有可能遭受杂菌的污 染。染菌的结果，轻者影响产量或产品质量，重者 可能导致倒罐，用的微生物菌种、培养基 以及发酵的条件、产物的性质不同，染菌造成的危 害程度也不同。
青霉素的发酵过程 许多杂菌都能产生青霉素酶使 青霉素迅速分解破坏，使目标产物得率降低。 核苷或核苷酸 生产菌种是多种营养缺陷型微生物， 生长能力差，所需的培养基营养丰富，因此容易受 到杂菌的污染。
六、染菌对三废处理的影响 使过滤后的废菌体无法利用，发酵染 菌的废液，生物需氧量（BOD）增高，增加 三废治理费用和时间。 七、发酵染菌的危害 1．直接经济损失 2．间接经济损失
第二节 发酵异常现象及分析
一、种子培养和发酵的异常现象 种子培养和发酵的异常现象是指发酵过程中 的某些物理参数、化学参数或生物参数发生与原 有规律不同的改变，这些改变必然影响发酵水平， 使生产蒙受损失。 1．种子培养异常 培养的种子质量不合格。 种子培养异常的表现主要有菌体生长缓慢、 菌丝结团、菌体老化以及培养液的理化参数变化。
柠檬酸等有机酸 一般在产酸后，发酵液的pH值 比较低，杂菌生长十分困难，在发酵中后期不太 会发生染菌，主要是要预防发酵前期染菌。
谷氨酸发酵周期短，生产菌繁殖快，培养基不太 丰富，一般较少污染杂菌，但噬菌体污染对谷氨 酸发酵的威胁非常大 不管是对于哪种发酵过程，一旦发生染菌， 都会由于培养基中的营养成分被消耗或代谢产物 被分解，严重影响到产物的生成，使发酵产品的 产量大为降低。
由于种子质量差或种子低温放臵时间长导致菌体数量 较少、停滞期延长、发酵液内菌体数量增长缓慢、外形不 整齐。 (2)pH值过高或过低
(3)溶解氧水平异常 (4)泡沫过多 (5)菌体浓度过高或过低 在发酵生产过程中菌体或菌丝浓度的变化是按其固有 的规律进行的。但是如罐温长时间偏高，或停止搅拌时间 较长造成溶氧不足，或培养基灭菌不当导致营养条件较差， 种子质量差、菌体或菌丝自溶等均会严重影响到培养物的 生长，导致发酵液中菌体浓度偏离原有规律，出现异常现 象。
3、平板划线培养或斜面培养检查法
将待检样品在无菌平板上划线，分别于 37℃进行培养，一般24h•后即可进行镜检 观察，检查是否有杂菌。有时为了提高平 板培养法的灵敏度，也可以将需要检查的 样品先臵于37℃条件下培养六小时，使杂 菌迅速增殖后再划线培养。
４、发酵过程的异常现象观察法 根据发酵过程出现的异常现象如溶解氧、 pH值、排出气中的CO2含量以及微生物菌体 酶活力等的异常变化来检查发酵是否染菌。 对于特定的发酵过程具有一定的溶解氧 水平，而且在不同的发酵阶段其溶解氧的 水平也是不同的。如果发酵过程中的溶解 氧水平发生了异常的变化，一般就是发酵 染菌发生的表现。
一、发酵染菌率
1．总染菌率：指一年内发酵染菌的批次与总 投料批次数之比乘以100得到的百分率。 2．设备染菌率：统计发酵罐或其他设备的染 菌率，有利于查找因设备缺陷而造成的染 菌原因。 3．不同品种发酵的染菌率：统计不同品种发 酵的染菌率，有助于查找不同品种发酵染 菌的原因。
4．不同发酵阶段的染菌率：将整个发酵周期 分成前期、中期和后期三个阶段，分别统计 其染菌率。有助于查找染菌的原因。 5．季节染菌率：统计不同季节的染菌率，可 以采取相应的措施制服染菌。 6．操作染菌率：统计操作工的染菌率，一方 面可以分析染菌原因，另一方面可以考核操 作工的灭菌操作技术水平。
二、染菌原因的分析
在发酵生产中，往往因为生产过程的环节很 多，同时各工厂的生产设备、产品种类和管理措 施不尽相同，引起染菌的原因比较复杂，有时不 能及时找出而耽误了生产。如果原因一经查出， 解决的办法还是比较容易和迅速的。 所以，我们必须善于透过现象看本质，对染 菌的情况作具体分析，不致盲目寻找而耽误了时 间，也不致于将染菌的真正原因遗漏而造成连续 染菌事故。根据发酵工厂的生产经验，从一般染 菌的现象来分析引起染菌的可能原因。
种子带菌 空气带菌
无菌室 沙土管，试管 培养基
污染途径
操作失误 设备 噬菌体
二、发酵过程中染菌的检查与判断
发酵过程是否染菌应以无菌试验的结果 为依据进行判断。 在发酵中及早发现杂菌的污染并及时采 取措施加以处理，是避免染菌造成严重经 济损失的重要手段。 生产上要求能确切、迅速的方法检查出 杂菌的污染。借助适当的方法，才能正确 而及时地发现发酵过程是否污染杂菌和染 菌的原因与途径。
判断发酵是否染菌应以无菌试验结果 为根据。
无菌试验的目的： （1）监测培养基、发酵罐及附属设备灭菌是 否彻底 （2）监测发酵过程中是否有杂菌从外界侵入 （3）了解整个生产过程中是否存在染菌的隐 患和死角
各种检查方法的比较
各有优缺点 显微镜检查方法简便、快速，能及时发现 杂菌，但由于镜检取样少，视野的观察面 也小，因此不易检出早期杂菌。 平板划线法的缺点是需经较长时间培养(一 般要过夜)才能判断结果，且操作较繁琐， 但它要比显微镜能检出更少的杂菌。


在发酵前期，微生物菌体主要是处于生长、繁殖 阶段，此时期代谢的产物很少。
杂菌与生产菌争夺培养基中的营养物质，严重干 扰生产菌的正常生长、繁殖及产物的生成。
(3)发酵中期染菌 大量消耗营养物质，严重干扰生产菌的 代谢，影响产物的生成。 杂菌大量繁殖，产生酸性物质，使pH值 下降，糖、氮等的消耗加速，菌体发生自溶， 致使发酵液发黏，产生大量的泡沫，代谢产 物的积累减少或停止； 有的染菌后会使已生成的产物被利用或 破坏。 一般较难挽救，危害性较大 “早发现，快处理”。
第三节 发酵染菌率和 染菌原因的分析
发酵染菌能给生成带来严重危害，防止杂菌 污染是任何发酵工厂的一项重要工作内容。染菌 问题是影响产率和后工序操作的主要因素之一， 必须予以重视。 根据以往工厂中发生染菌事故的经验教训来 分析发酵系统中染菌的原因，来认识整个发酵过 程中可能造成污染的各种途径并提出相应的防治 措施。由于发酵生产的连贯性强，在整个生产过 程中各个环节的污染问题都不能忽视。
表92国外一抗生素发酵染菌原因的分析染菌原因百分率染菌原因百分率种子带菌培养基灭菌不透空气系统带菌搅拌轴密封泄漏泡沫冒顶夹套穿孔96401907919962090481236蛇管穿孔接种管穿孔阀门泄漏罐盖漏其他设备漏操作问题原因不明589039145154101310152491表93国内一制药厂发酵染菌原因的分析染菌原因百分率外界带入杂菌取样补料带入设备穿孔空气系统带菌停电罐压跌零接种蒸汽压力不够或蒸汽量不足管理问题操作违反规程种子带菌原因不明8207602600160110006070916006035001大批发酵罐染菌2部分发酵罐或罐组染菌3个别发酵罐连续染菌和偶然染菌发酵中期后期且这些杂菌类型相同则一般是空气净化系统存在诸如空气系统结构不合理空气过滤器介质失效等问题
国内外抗菌素生产中统计了多年生产 中发生染菌现象的各种原因所占的百分比， 今列出以供参考。 国外一抗生素发酵染菌原因的分析， 如表9-2。国内一制药厂发酵染菌原因的分 析如表9-3。
表9-2 国外一抗生素发酵染菌原因的分析
百分率（%） 染菌原因 百分率（%） 5.89 0.39 1.45 1.54 10.13 10.15 24.91
(1)菌体生长缓慢
原因：培养基原料质量下降、菌体老化、 灭菌操作失误、供氧不足、培养温度偏高 或偏低、酸碱度调节不当等；

接种物冷藏时间长或接种量过低而导致 菌体量少，或接种物本身质量差等也都会 使菌体数量增长缓慢。
(2)菌丝结团 有些丝状菌容易产生菌丝团，菌体仅在表 面生长，菌丝向四周伸展，而菌丝团的中央结 实，使内部菌丝的营养吸收和呼吸受到很大影 响，从而不能正常地生长。
三、杂菌检查中的问题
1．检查结果应以平板划线和肉汤培养结果为 主要根据 2．平板划线和肉汤培养应做三个平行样 3．要定期取样 4．酚红肉汤和平板划线培养样品应保存至放 罐后12小时，确定为无菌时方可弃去 5．取样时防止外界杂菌混入的措施
四、检查的工序和时间
科学合理的选择检查工序和时间，对于 除去已污染杂菌的物料，避免下道工序再 遭染菌，有着直接的指导意义。 由于生产菌种、产品的不同，检查的时 间也不完全一样，但总的原则是一致的， 即每个工序或经一定时间都应进行取样检 查。 检查的一般时间或工序见下表9-1 发酵 工程杂菌的检查。
三、不同染菌时间对发酵的影响
1．种子培养期染菌 2．发酵前期染菌 3．发酵中期染菌 4．发酵后期染菌
(1)种子培养期染菌
种子培养主要是使微生物细胞生长与繁殖


微生物菌体浓度低，培养基的营养丰富，易染菌， 危害极大。
经灭菌后弃去，并对种子罐、管道等进行仔细 检查和彻底灭菌。 (2)发酵前期染菌
2．发酵异常 不同种类的发酵过程所发生的发酵异 常现象，形式虽然不尽相同，但均表现出 菌体生长速率缓慢、菌体代谢异常或过早 老化、耗糖慢、pH值的异常变化、发酵过 程中泡沫的异常增多、发酵液颜色的异常 变化、代谢产物含量的异常下跌、发酵周 期的异常拖长、发酵液的黏度异常增加等。
(1)菌体生长差
(4)发酵后期染菌 营养物质已接近耗尽，产物积累较多。 如杂菌量不大，可继续发酵。 如污染严重，可采取措施提前放罐 发酵后期染菌对不同产物的影响也是不 同的，如抗生素、柠檬酸的发酵，染菌对产 物的影响不大； 肌苷酸、谷氨酸、氨基酸等的发酵， 后期染菌也会影响产物的产量、提取和产品 的质量。
2．对提取的影响
（1）有机溶剂萃取工艺： 染菌的发酵液含有更多的水溶性蛋白质， 易发生乳化，使水相和溶剂相难以分开 （2）离子交换工艺： 杂菌易粘附在离子交换树脂表面或被离 子交换树脂吸附，大大降低离子交换树脂 的交换量
3．对产品质量的影响
（1）对内在质量的影响： 染菌的发酵液含有较多的蛋白质和其它杂质。 对产品的纯度有较大影响。 （2）对产品外观的影响： 一些染菌的发酵液经处理过滤后得到澄清的 发酵液，放臵后会出现混浊，影响产品的外观。
二、杂菌的检查与判断
1．显微镜检查法（镜检法）
2．肉汤培养法 3、平板划线培养或斜面培养检查法 ４、发酵过程的异常现象观察法
1．显微镜检查法（镜检法）
用革兰氏染色法对样品进行涂片、染 色，然后在显微镜下观察微生物的形态特 征，根据生产菌与杂菌的特征区别，判断 是否染菌。
2．肉汤培养法 通常用组成为0.3%牛肉膏、0.5%葡萄糖、 0.5%氯化钠、0.8%蛋白胨、0.4%的1%酚红 溶液（pH7.2）的葡萄糖酚红肉汤作为培养 基，将待检样品直接入经完全灭菌后的肉 汤培养基中，分别于37℃、27℃进行培养， 一般24h后即可进行镜检观察，检查是否有 杂菌。
染菌原因
种子带菌 接种时罐压跌零 培养基灭菌不透 空气系统带菌 搅拌轴密封泄漏 泡沫冒顶 夹套穿孔 9.64 0.19 0.79 19.96 2.09 0.48 12.36 蛇管穿孔 接种管穿孔 阀门泄漏 罐盖漏 其他设备漏 操作问题 原因不明