第二章高效液相色谱法
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2. 分配色谱（液-液分配色谱）
早期通过在担体上涂渍一薄层固定液制备固定相, 现多为化学键合固定相，即用化学反应的方法通过化学键 将固定液结合在担体表面。
7/24/2020
3. 离子交换色谱
固定相为离子交换树脂，流动相为无机酸或无机碱 的水溶液。各种离子根据它们与树脂上的交换基团的交 换能力的不同而得到分离。
（2）由于液体的扩散性比气体的小105倍，因此，
溶质在液相中的传质速率慢，而在气相色谱中 气体的传质速率要快得多。
7/24/2020
（3）液相色谱能完成难度较高的分离工作
①气相色谱的流动相载气是色谱惰性的，而在 液相色谱中流动相液体也与固定相争夺样品分子， 为提高选择性增加了一个因素。
②液相色谱固定相类型多，作为分析时选择余 地大；而气相色谱并不可能的。
高效液相色谱法的仪器设备费用昂贵， 操作严格，这是它的主要缺点。
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二、流程及主要部件
1.流程
高压输液系统 —— 进样系统 —— 分离系统—— 检测系统 —— 数据处理系统
7/24/2020
7/24/2020
Agilent 1100 LC的主要部件
2.主要部件
(1) 高压输液系统
7/24/2020
(2) 梯度淋洗装置
外梯度: 利用两台高压输液泵，
将两种不同极性的溶剂按一 定的比例送入梯度混合室， 混合后进入色谱柱。
内梯度: 一台高压泵, 通过比例
调节阀,将两种或多种不同 极性的溶剂按一定的比例抽 入高压泵中混合中为高压力工作状态，通常使用耐高压的六 通阀进样装置，也可配备自动进样装置。
③ 液相色谱通常在室温下操作，较低的温度， 一般有利于色谱分离条件的选择，而气相色谱一 般都在较高温度下进行的。
（4）液相色谱中制备样品简单，回收样品也比较容 易，而且回收是定量的，适合于大量制备。但液相色 谱尚缺乏通用的检测器，仪器比较复杂，价格昂贵。
7/24/2020
2．高效液相色谱法与经典液相色谱法比较
1. 在食品分析中的应用
• 1)食品营养成分分析：蛋白质、氨基酸、糖类 等；
• 2)食品添加剂分析：防腐剂、着色剂等； • 3)食品污染物分析：霉菌毒素等。
2. 在环境分析中的应用
• 多环芳烃（特别是稠环芳烃）、农药残留等。
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五、高效液相色谱法的应用
3. 在生命科学中的应用
• 1) 低分子量物质，如氨基酸、糖类、维生素等 的分离和测定。
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小结
综上所述，高效液相色谱法是吸取了气 相色谱与经典液相色谱的优点，具有高柱 效、高选择性、分析速度快、灵敏度高、 重复性好、应用范围广等优点。
目前高效液相色谱法已被广泛应用于分 析对生物学和医药上有重大意义的大分子 物质，例如蛋白质、核酸、氨基酸、多糖 类、植物色素、高聚物、染料及药物等物 质的分离和分析。
其结构如图所示：
7/24/2020
(4) 高效分离系统
色谱分离系统包括色谱柱、固定相和流动相。色谱 柱是其核心部分，柱体为直型不锈钢管，内径1～6 mm，柱长5～40 cm。 发展趋势是减小填料粒度和柱径以提高柱效。
7/24/2020
(5) 高效液相色谱检测器
紫外光度检测器（UVD）：最小检测量10-9g·mL-1， 对流量和温度的波动不敏感，可用于梯度洗脱。
高效液相色谱法比起经典液相色谱法的最大优 点在于高速、高效、高灵敏度、高自动化。
例如对氨基酸分离，用经典色谱法需用20多小 时才能分离出20种氨基酸；而用高效液相色谱法，只 需lh之内即可完成。
又如用25cm×0.46cm的Lichrosorb－ODS(5μ) 的柱，采用梯度洗脱，可在不到0.5h内分离出尿中 104个组分.
• 2) 高分子量物质，如蛋白质和酶的纯化、分离 和测定。
4. 在医学检验中的应用
• 1）合成药物：抗生素、抗忧郁药物等。 • 2）天然药物生物碱（鸦片碱）等
5．在无机分析中的应用
• 阳、阴离子的分析等。
7/24/2020
请选择内容：
第一节 色谱法概述
第二节 气相色谱仪
第三节 色谱理论基础
第四节 气相色谱操作条件选择
（3）若淋洗液的极性大于固定液的极性，则称为反相液 液色谱，非极性柱也称为反相柱。组分在两种类型分离柱上 的出峰顺序相反。
7/24/2020
流动相组成
流动相按组成不同可分为单组分和多组分； 按极性可分为极性、弱极性、非极性； 按使用方式有固定组成淋洗和梯度淋洗。 常用溶剂: 己烷、四氯化碳、甲苯、乙酸乙酯、乙醇、乙腈、水。 采用二元或多元组合溶剂作为流动相可以灵活调节流动相 的极性或增加选择性，以改进分离或调整出峰时间。
（4）流动相同时还应满足检测器的要求。当使用紫外 检测器时，流动相不应有紫外吸收。
7/24/2020
四、 高效液相色谱法的主要分离类型
1. 吸附色谱（液-固吸附色谱）
“液-固色谱法”是利用各组分在固定相上吸附能力 的不同而将它们分离的方法。以固体吸附剂为固定相，如 硅胶、氧化铝等，较常使用的是5～10μm的硅胶吸附剂。 流动相可以是各种不同极性的一元或多元溶剂。
最常用的检测器。
7/24/2020
光电二极管阵列检测器
光电二极管阵列检测器：1024个二极管阵列，各检测特 定波长，计算机快速处理，三维立体谱图，如图所示。
7/24/2020
（6） 数据处理系统
色谱工作站的功能：
• 色谱参数的选择和设定； • 自动化操作仪器； • 色谱数据的采集和存储，并作“实时”处理； • 对采集和存储的数据进行后处理； • 自动打印，给出一套完整的色谱分析数据和图谱。 • 同时也可把一些常用色谱参数、操作程序，及各种
主要部件之一，包括贮液装置、高压输液泵、过滤器、脱 气装置等 高压输液泵压力：150～350×105 Pa。 为了获得高柱效而使用粒度很小的固定相（<10μm），液 体的流动相高速通过时，将产生很高的压力，因此高压、高 速是高效液相色谱的特点之一。 基本要求：
应具有压力平稳、脉冲小、流量稳 定可调、耐腐蚀等特性
第二章
高效液相色谱法
一、高效液相色谱法 的特点
二、流程及主要部件 三、影响分离的因素 四、高效液相色谱法
的主要分离类型
7/24/2020
液相色谱仪（1）
7/24/2020
液相色谱仪（2）
7/24/2020
液相色谱仪（3）
7/24/2020
液相色谱仪（4）
7/24/2020
液相色谱仪（5）
7/24/2020
选择短柱、细内径提高分析速度；
研制高效柱填料是一活跃领域。
7/24/2020
2. 流动相及流动相的极性
（1）可显著改变组分分离状况的流动相选择在液相色谱 中显得特别重要。 液相色谱的流动相又称为：淋洗液，洗脱 剂。
（2）亲水性固定液常采用疏水性淋洗液，即淋洗液的极 性小于固定相的极性，称为正相液液色谱法，极性柱也称正 相柱。
定量计算方法存入存储器中，需用时调出直接使用。
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7/24/2020
三、影响分离的因素 1. 固定相及分离柱
气相色谱中的固定液原则上都可以用于液相色 谱，其选用原则与气相色谱一样。
选择合适的固定相，降低填料粒度可显著提高 柱效，但在高效液相色谱中，分离柱的制备是一项 技术要求非常高的工作，一般很少自行制备。
一、高效液相色谱法的特点
特点：高压、高效、高速 高沸点、热不稳定有机及生化试样的高效分离分析方法。
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1．高效液相色谱法与气相色谱法比较
（1）应用范围不同
气相色谱仅能分析在操作温度下能气化而不 分解的物质。据统计只有大约20%的有机物能 用气相色谱分析；而液相色谱适合分子量较大、 难气化、不易挥发或对热敏感的物质、离子型 化合物及高聚物的分离分析，大约占有机物的 70 ~ 80%。
可分离分析：核苷酸、碳水化合物、有机酸、蛋白 质、酶等
4. 凝胶色谱（空间排阻色谱）
按分子尺寸的差异进行分离的一种液相色谱方法。以 凝胶为固定相。凝胶是一种经过交联的、具有立体网状 结构和不同孔径的多聚体的通称。如葡聚糖凝胶、琼脂 糖等软质凝胶；多孔硅胶、聚苯乙烯凝胶等硬质凝胶。
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五、高效液相色谱法的应用
第五节 色谱定性、定量方法
第六节 毛细管色谱
第七节 液相色谱法
第八节 离子色谱法
第九节 高效毛细管电泳
第十节 薄层色谱与纸色谱法
结束
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选择流动相时应注意的几个问题：
（1）尽量使用高纯度试剂作流动相，防止微量杂质长期累 积损坏色谱柱和使检测器噪声增加。
（2）避免流动相与固定相发生作用而使柱效下降或损坏 柱子。如使固定液溶解流失；酸性溶剂破坏氧化铝固定 相等。
（3）试样在流动相中应有适宜的溶解度，防止产生沉 淀并在柱中沉积。
早期通过在担体上涂渍一薄层固定液制备固定相, 现多为化学键合固定相，即用化学反应的方法通过化学键 将固定液结合在担体表面。
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3. 离子交换色谱
固定相为离子交换树脂，流动相为无机酸或无机碱 的水溶液。各种离子根据它们与树脂上的交换基团的交 换能力的不同而得到分离。
（2）由于液体的扩散性比气体的小105倍，因此，
溶质在液相中的传质速率慢，而在气相色谱中 气体的传质速率要快得多。
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（3）液相色谱能完成难度较高的分离工作
①气相色谱的流动相载气是色谱惰性的，而在 液相色谱中流动相液体也与固定相争夺样品分子， 为提高选择性增加了一个因素。
②液相色谱固定相类型多，作为分析时选择余 地大；而气相色谱并不可能的。
高效液相色谱法的仪器设备费用昂贵， 操作严格，这是它的主要缺点。
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二、流程及主要部件
1.流程
高压输液系统 —— 进样系统 —— 分离系统—— 检测系统 —— 数据处理系统
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Agilent 1100 LC的主要部件
2.主要部件
(1) 高压输液系统
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(2) 梯度淋洗装置
外梯度: 利用两台高压输液泵，
将两种不同极性的溶剂按一 定的比例送入梯度混合室， 混合后进入色谱柱。
内梯度: 一台高压泵, 通过比例
调节阀,将两种或多种不同 极性的溶剂按一定的比例抽 入高压泵中混合中为高压力工作状态，通常使用耐高压的六 通阀进样装置，也可配备自动进样装置。
③ 液相色谱通常在室温下操作，较低的温度， 一般有利于色谱分离条件的选择，而气相色谱一 般都在较高温度下进行的。
（4）液相色谱中制备样品简单，回收样品也比较容 易，而且回收是定量的，适合于大量制备。但液相色 谱尚缺乏通用的检测器，仪器比较复杂，价格昂贵。
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2．高效液相色谱法与经典液相色谱法比较
1. 在食品分析中的应用
• 1)食品营养成分分析：蛋白质、氨基酸、糖类 等；
• 2)食品添加剂分析：防腐剂、着色剂等； • 3)食品污染物分析：霉菌毒素等。
2. 在环境分析中的应用
• 多环芳烃（特别是稠环芳烃）、农药残留等。
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五、高效液相色谱法的应用
3. 在生命科学中的应用
• 1) 低分子量物质，如氨基酸、糖类、维生素等 的分离和测定。
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小结
综上所述，高效液相色谱法是吸取了气 相色谱与经典液相色谱的优点，具有高柱 效、高选择性、分析速度快、灵敏度高、 重复性好、应用范围广等优点。
目前高效液相色谱法已被广泛应用于分 析对生物学和医药上有重大意义的大分子 物质，例如蛋白质、核酸、氨基酸、多糖 类、植物色素、高聚物、染料及药物等物 质的分离和分析。
其结构如图所示：
7/24/2020
(4) 高效分离系统
色谱分离系统包括色谱柱、固定相和流动相。色谱 柱是其核心部分，柱体为直型不锈钢管，内径1～6 mm，柱长5～40 cm。 发展趋势是减小填料粒度和柱径以提高柱效。
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(5) 高效液相色谱检测器
紫外光度检测器（UVD）：最小检测量10-9g·mL-1， 对流量和温度的波动不敏感，可用于梯度洗脱。
高效液相色谱法比起经典液相色谱法的最大优 点在于高速、高效、高灵敏度、高自动化。
例如对氨基酸分离，用经典色谱法需用20多小 时才能分离出20种氨基酸；而用高效液相色谱法，只 需lh之内即可完成。
又如用25cm×0.46cm的Lichrosorb－ODS(5μ) 的柱，采用梯度洗脱，可在不到0.5h内分离出尿中 104个组分.
• 2) 高分子量物质，如蛋白质和酶的纯化、分离 和测定。
4. 在医学检验中的应用
• 1）合成药物：抗生素、抗忧郁药物等。 • 2）天然药物生物碱（鸦片碱）等
5．在无机分析中的应用
• 阳、阴离子的分析等。
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请选择内容：
第一节 色谱法概述
第二节 气相色谱仪
第三节 色谱理论基础
第四节 气相色谱操作条件选择
（3）若淋洗液的极性大于固定液的极性，则称为反相液 液色谱，非极性柱也称为反相柱。组分在两种类型分离柱上 的出峰顺序相反。
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流动相组成
流动相按组成不同可分为单组分和多组分； 按极性可分为极性、弱极性、非极性； 按使用方式有固定组成淋洗和梯度淋洗。 常用溶剂: 己烷、四氯化碳、甲苯、乙酸乙酯、乙醇、乙腈、水。 采用二元或多元组合溶剂作为流动相可以灵活调节流动相 的极性或增加选择性，以改进分离或调整出峰时间。
（4）流动相同时还应满足检测器的要求。当使用紫外 检测器时，流动相不应有紫外吸收。
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四、 高效液相色谱法的主要分离类型
1. 吸附色谱（液-固吸附色谱）
“液-固色谱法”是利用各组分在固定相上吸附能力 的不同而将它们分离的方法。以固体吸附剂为固定相，如 硅胶、氧化铝等，较常使用的是5～10μm的硅胶吸附剂。 流动相可以是各种不同极性的一元或多元溶剂。
最常用的检测器。
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光电二极管阵列检测器
光电二极管阵列检测器：1024个二极管阵列，各检测特 定波长，计算机快速处理，三维立体谱图，如图所示。
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（6） 数据处理系统
色谱工作站的功能：
• 色谱参数的选择和设定； • 自动化操作仪器； • 色谱数据的采集和存储，并作“实时”处理； • 对采集和存储的数据进行后处理； • 自动打印，给出一套完整的色谱分析数据和图谱。 • 同时也可把一些常用色谱参数、操作程序，及各种
主要部件之一，包括贮液装置、高压输液泵、过滤器、脱 气装置等 高压输液泵压力：150～350×105 Pa。 为了获得高柱效而使用粒度很小的固定相（<10μm），液 体的流动相高速通过时，将产生很高的压力，因此高压、高 速是高效液相色谱的特点之一。 基本要求：
应具有压力平稳、脉冲小、流量稳 定可调、耐腐蚀等特性
第二章
高效液相色谱法
一、高效液相色谱法 的特点
二、流程及主要部件 三、影响分离的因素 四、高效液相色谱法
的主要分离类型
7/24/2020
液相色谱仪（1）
7/24/2020
液相色谱仪（2）
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液相色谱仪（3）
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液相色谱仪（4）
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液相色谱仪（5）
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选择短柱、细内径提高分析速度；
研制高效柱填料是一活跃领域。
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2. 流动相及流动相的极性
（1）可显著改变组分分离状况的流动相选择在液相色谱 中显得特别重要。 液相色谱的流动相又称为：淋洗液，洗脱 剂。
（2）亲水性固定液常采用疏水性淋洗液，即淋洗液的极 性小于固定相的极性，称为正相液液色谱法，极性柱也称正 相柱。
定量计算方法存入存储器中，需用时调出直接使用。
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三、影响分离的因素 1. 固定相及分离柱
气相色谱中的固定液原则上都可以用于液相色 谱，其选用原则与气相色谱一样。
选择合适的固定相，降低填料粒度可显著提高 柱效，但在高效液相色谱中，分离柱的制备是一项 技术要求非常高的工作，一般很少自行制备。
一、高效液相色谱法的特点
特点：高压、高效、高速 高沸点、热不稳定有机及生化试样的高效分离分析方法。
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1．高效液相色谱法与气相色谱法比较
（1）应用范围不同
气相色谱仅能分析在操作温度下能气化而不 分解的物质。据统计只有大约20%的有机物能 用气相色谱分析；而液相色谱适合分子量较大、 难气化、不易挥发或对热敏感的物质、离子型 化合物及高聚物的分离分析，大约占有机物的 70 ~ 80%。
可分离分析：核苷酸、碳水化合物、有机酸、蛋白 质、酶等
4. 凝胶色谱（空间排阻色谱）
按分子尺寸的差异进行分离的一种液相色谱方法。以 凝胶为固定相。凝胶是一种经过交联的、具有立体网状 结构和不同孔径的多聚体的通称。如葡聚糖凝胶、琼脂 糖等软质凝胶；多孔硅胶、聚苯乙烯凝胶等硬质凝胶。
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五、高效液相色谱法的应用
第五节 色谱定性、定量方法
第六节 毛细管色谱
第七节 液相色谱法
第八节 离子色谱法
第九节 高效毛细管电泳
第十节 薄层色谱与纸色谱法
结束
7/24/2020
选择流动相时应注意的几个问题：
（1）尽量使用高纯度试剂作流动相，防止微量杂质长期累 积损坏色谱柱和使检测器噪声增加。
（2）避免流动相与固定相发生作用而使柱效下降或损坏 柱子。如使固定液溶解流失；酸性溶剂破坏氧化铝固定 相等。
（3）试样在流动相中应有适宜的溶解度，防止产生沉 淀并在柱中沉积。