氢化可的松纯度标准物质的研制

氢化可的松纯度标准物质的研制
戴新华;何海红;苏福海;杨梦瑞;黄挺;全灿
【摘要】介绍纯度标准物质氢化可的松的研制方法.采用高效液相色谱法对该标准物质进行了定值及均匀性、稳定性检验.该标准物质定值结果为99.5%,扩展不确定度为0.2%,其均匀性和稳定性检验结果表明,该标准物质符合国家一级标准物质的技术要求.
【期刊名称】《化学分析计量》
【年(卷),期】2009(018)003
【总页数】4页(P4-7)
【关键词】氢化可的松;标准物质;高效液相色谱法;均匀性;稳定性
【作者】戴新华;何海红;苏福海;杨梦瑞;黄挺;全灿
【作者单位】中国计量科学研究院化学计量与分析科学研究所,北京,100013;中国计量科学研究院化学计量与分析科学研究所,北京,100013;中国计量科学研究院化学计量与分析科学研究所,北京,100013;中国计量科学研究院化学计量与分析科学研究所,北京,100013;中国计量科学研究院化学计量与分析科学研究所,北
京,100013;中国计量科学研究院化学计量与分析科学研究所,北京,100013
【正文语种】中文
【中图分类】O6
临床检验结果准确并具有跨时空的可比性是防病、治病和提高人类健康水平的基本
前提。

实现检验结果准确和不同时间、地点的可比性最有效的手段是建立和保证检验结果的溯源性。

开展检验量值溯源的必要条件是具备参考系统。

临床检验参考系统包括标准物质、参考方法和参考实验室，其中标准物质是最为重要的要素。

临床检验标准物质可使试剂生产厂家在制备试剂盒时，使用标准物质来保证其试剂检测结果的溯源性；其次，临床实验室工作人员在实际工作中，使用标准物质来验证试剂盒方法、工作程序的实际有效性。

这些都是保证日常检验结果准确性的必由之路，也是不同实验室间的检验结果走向有条件互认的前提。

氢化可的松是由肾上腺皮质束状带及网状带细胞所分泌，临床上常以血清氢化可的松作为筛选肾上腺皮质功能异常的首选指标。

为了建立临床氢化可的松的参考系统，笔者研制了氢化可的松纯度标准物质，以确保全国不同临床检测机构氢化可的松检测结果的可溯源性、可比性和可靠性。

1 实验部分
1.1 主要仪器与试剂
液相色谱仪：Agilent1100型,美国Agilent公司；
红外光谱仪：Bruker TENSOR27型,美国Bruker公司；
液相色谱-质谱联用仪：LTQ型，美国Thermo公司；
电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)：7500CE型，美国Agilent公司；
纯品氢化可的松：纯度大于99%，美国Sigma公司；
甲醇、乙腈：高效液相色谱级，美国Merck公司；
乙酸铵：分析纯，美国Tedia公司；
实验用其它试剂均为分析纯；
实验用水为Millipore高纯三次水。

1.2 原料纯化与标准物质分装
纯品氢化可的松固体为市售产品，采用了重结晶方法对其进行纯化处理。

初步测定
其纯度大于99%，分装至棕色的玻璃瓶中，单元数为200瓶，每瓶约100 mg，
避光密封于4℃下保存。

1.3 定性分析
对于固体纯品的主体成分，采用液相色谱-质谱联用法和红外光谱法进行定性分析。

将固体纯品配制成浓度为1.0 μg/mL的甲醇溶液，采用流动注射方式进行液相色
谱-电喷雾离子化-离子阱质谱联用分析。

将固体纯品与溴化钾粉末混合研磨，在红外光谱仪上进行分析。

1.4 定量分析
主成分定值方法参照国际上各国家计量实验室通用方法。

高纯有机化合物标准物质的定值方案，国外最早形成于20世纪70年代，对样品纯度为99%以上的化合物，通常选择气相色谱归一化法、高效液相色谱归一化法、差示扫描量热法等。

本研究采用高效液相色谱归一化法对氢化可的松固体纯品进行定值。

通常只能用HPLC
法对氢化可的松定值。

按照“国家一级标准物质技术规范”的要求，采用了多家定值的方法对氢化可的松纯度标准物质进行了定值。

水分测定：采用热重法(TGA法)进行水分的测定。

无机离子测定：基于DZ/T 0223-2001电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)分析方法通则，采用美国Agilent公司的7500CE分析测试。

2 结果与讨论
2.1 定性分析
首先采用液相色谱-质谱联用方法对主成分进行定性分析。

采用正离子模式进行离
子化，离子扫描m/z范围约在100～400，进行一级质谱分析，通过样品的分子
离子峰与分子量的对应关系，可以对主体成分进行初步定性分析。

根据谱图上分子离子峰(M+H)+的质荷比m/z为363.4约等于氢化可的松的相对分子质量(362.46)
加上氢的相对原子质量(1.0)，可以初步对氢化可的松定性。

为了进一步确证主成分，还采用了红外光谱法进行分析。

对照相关原料化合物的标准红外光谱图，对原料主体成分进行定性分析，其谱图与标准红外光谱图一致。

通过以上两种方法，证明了其主要成分为氢化可的松。

2.2 定量分析
用于固体纯品定值的色谱仪都要严格按照国家计量检定规程的要求进行检定，仪器的噪声(HPLC/UV或DAD检测器)、漂移、仪器的重复性的指标均符合检定规程
的要求，仪器处于最佳状态。

在定值条件下，通过最小检测峰面积的设定，保证0.003%以上的组分均可被检出，完全满足定值的要求。

对于含量小于0.1%的杂质，可以忽略，例如，主成分峰面积为10 304 mAU·s时，其杂质峰面积小于10的杂质都可以忽略。

为了优化HPLC各参数，主要研究检测波长、色谱柱填料类型、流动相有机溶剂
含量、缓冲盐种类及pH值、色谱柱温度等实验条件的影响，使各组分间达到完全分离。

根据纯品的制备和生产合成路线分析，其主体成分和可能存在的杂质成分除了合成过程中反应物、生成物和副产物外，就是它们各自的异构体，根据这些物质的化学结构分析判断，其在高效液相色谱的UV或DAD检测器上均有响应，因此实验中采用通用型(非选择性)检测器，如HPLC/UV或DAD等。

优化后的HPLC
方法检测条件如下：
色谱柱：Agilent Plus C18 (150 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相：甲醇-0.1%甲
酸水溶液(体积比为46∶54)，等度洗脱，流速为1.0 mL/min；进样量：10 μL(样品为1 mg/mL氢化可的松的甲醇溶液)；检测波长：203、242、254、280、300 nm(部分合作实验室使用UV：246 nm)；定值波长：242 nm；检测时间：22 min。

参与多家定值的实验室应具有标准物质定值的必备条件，并具有一定的技术权威性。

除了本实验室外选择北京科技大学、北京化工大学、卫生部心血管药物临床研究重点实验室、解放军总医院测试中心、中国医学科学院药物研究所、中国疾控中心职业卫生与中毒控制所、北京大学第三医院7家实验室进行合作定值。

8家实验室的测定结果列于表1。

对表1数据进行柯克伦检验：统计量C=0.341 1，临界值
C(α,m,n)=0.393 2，柯克伦检验结果为无异常值；对表1数据进行狄克逊检验：
r1=0.758 0，rn=0.068 5，f(α,n)=0.717，狄克逊检验有异常值，应舍弃平均值最小的第5个实验室。

剔除离群值，最终得到氢化可的松纯度定值结果为99.5%。

此外，针对LC/VWD或DAD中没有响应的化合物，进行了水分及无机元素等测试。

表1 氢化可的松纯度合作定值结果 %序号实验室编号
12345678199.4899.4899.4799.5899.1799.5799.4899.49299.4899.5099.4799. 5899.1799.5699.5299.48399.4899.4999.4899.5799.1799.5799.5299.47499.49 99.4799.4799.5899.1799.5799.4999.48599.5099.4899.4799.5799.1799.5799. 4899.49699.5199.5099.4799.5899.1599.5799.5199.48799.4999.5099.4799.57 99.1799.5799.5099.48平均值
99.4999.4999.4799.5899.1799.5799.5099.48s0.0100.0120.0040.0050.0080.0 040.020.006RSD0.0100.0120.0040.0050.0080.0040.020.006总平均值99.5s
总0.043RSD总0.043
水分分析采用热重法(TGA法)进行水分测定。

该方法的优点在于测定时所需样品
量较小(3～5 mg)，分析时间较短，数据处理方便，获得的信息量大。

该法不仅适用于样品中吸附水和结晶水的测定，而且适用于样品中有机溶剂的测定。

用该法测得氢化可的松的水分含量为0.030%。

水分含量小于0.1%时，对定值结果影响较小，可以忽略不计。

无机元素测定基于DZ/T 0223-2001电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)分析方法通
则，共测定了68种元素含量，其金属离子总量为0.000 02%(0.223 μg/g)，对纯度定值结果影响甚微，故可以忽略。

2.3 均匀性检验
根据文献[1，2]的要求对研制的标准物质进行了均匀性检验。

具体抽样检验方法为：从每种标准物质中随机抽取7个包装，进行瓶间均匀性检验；从其中任意一瓶中
取7个子样，进行瓶内均匀性检验，检验方法采用HPLC法，测量数据列于表2。

对表2数据进行F检验，F=0.335，F0.05(6,6)= 4.28，结论为样品均匀；进行t
检验，t=0.000，tα=0.004，结论为样品均匀。

表2 氢化可的松纯度标准物质均匀性检验结果 %项目含量平均值RSD瓶间99.48 99.52 99.52 99.4999.48 99.51 99.5099.500.02瓶内99.52 99.54 99.53
99.5099.47 99.46 99.5199.500.03
2.4 稳定性考察
标准物质稳定性考察按先密后疏的原则，在一定时间间隔内用液相色谱法在规定条件下在第1、3、6、12个月进行稳定性监测。

每次取2个包装，每个包装取2个子样，测定3次，计算平均值，以2个包装测量结果平均值作为检测结果。

以结
果的变动在定值结果不确定度范围内作为判定标准物质稳定的原则。

由于本研究时间较短，目前只考察了6个月的稳定性。

在考察期内，所研制的标准物质稳定，
稳定性检验结果见表3。

表3 氢化可的松纯度标准物质稳定性考察结果检测时间/月检测结果
/%099.50199.51399.49699.52
2.5 不确定度分析[1-5]
根据ISO、EURACHEM导则、JJF 1059-199，对采用液相色谱法测量氢化可的松纯度结果的不确定度进行了评定。

2.5.1 不确定度来源
定值结果的不确定度由3部分组成：标准物质的不均匀性引入的不确定度；标准物质的不稳定性引入的不确定度；标准物质的定值过程引入的不确定度。

2.5.2 不确定分量的评定
(1)不均匀性引入的不确定度(uH)
uH包括样品加工过程不均匀性、分装不均匀性以及平行实验分析间的偏差，标准物质的不均匀性以独立测量的平行实验来表示，即以瓶间与瓶内均匀性检验结果的相对标准偏差来表示。

由2.3部分均匀性检验结果可知，该标准物质均匀性良好，因此由不均匀性引入的不确定度可以忽略，即uH=0。

(2)标准物质的不稳定性引入的不确定度(uT)
uT以稳定性考察结果的相对标准偏差来表示。

在稳定性考察中要注意定值结果是否出现逐渐增大或减少的趁势，如果出现较大的方向性变化趋势，则应考虑选择更优的标准物质保存方式。

在稳定性监测期间内，稳定性变化很小，证明该标准物质是稳定的，由标准物质的不稳定性引入的不确定度可以忽略，即uT=0。

(3)标准物质的定值过程引入的不确定度
定值过程引入的不确定度可以分为两部分：液相色谱上没有响应的成分引入的不确定度和液相色谱法定值引入的不确定度。

①液相色谱没有响应的成分引入的不确定度
水分引入的不确定度：根据2.2(1)水分测定结果，由水分引入的不确定度可以忽略不计。

无机元素引入的不确定度：根据2.2(2)测定结果，氢化可的松中无机元素引入的不确定度可以忽略不计。

②液相色谱法定值引入的不确定度
多家定值结果的平均值引入的不确定度u1：将多家定值结果的平均值作为一组新的测量值，取该组测量值的相对标准偏差作为u1值，u1=0.043%。

定值用方法重复性引入的不确定度u2：取各家定值结果中最大的相对标准偏差作为u2值，u2=0.02%。

多家定值用方法的响应因子产生的不确定度u3=0.082%。

因此标准物质定值过程引入的不确定度为：
2.5.3 合成不确定度和扩展不确定度
标准物质定值结果的合成不确定度为：
取包含因子k=2，则扩展不确定度为：
U=kuc=0.2%
氢化可的松的纯度表示为99.5%±0.2%，k=2。

3 结论
应国内急需高水平临床检验标准物质的需求，开展了氢化可的松纯度标准物质的研制工作，按照国家一级标准物质技术规范进行了均匀性检验和稳定性检验，用高效液相色谱法进行定值。

该标准物质符合国家一级标准物质要求，填补了国内该领域的空白。

该标准物质可为临床检验、医学、营养学、卫生检验检疫等方面的测量和研究工作提供技术支撑和量值溯源保障。

参考文献
[1] 全浩，韩永志. 标准物质及其应用技术[M].第2版.北京：中国标准出版社，2003.
[2] JJG 1006-1994 一级标准物质技术规范[S].
[3] 李慎安，施昌彦，刘风.测量不确定度评定与表示[M].北京：中国计量出版社，1999.
[4] JJF 1059-1999 测量不确定度评定与表示[S].
[5] ISO/GUM(1993) Guide to the expression of uncertainty in measurement[S].。