生物化学实验_代谢部分_PPT课件

2. 器材 (1) 解剖刀、剪及镊子。 (2) 解剖盘。 (3) 表面皿。 (4) 匀浆器。 (5) 台秤。 (6) 离心管和离心机（台式） (7) 试管及试管架 (8) 恒温水浴 (9) 毛细玻璃管
(10)直尺 (11)2H铅笔 (12)层析滤纸（国产新华1号滤纸） (13)电热鼓风干燥箱 (14)层析用具：玻璃钟罩、层析缸和小
本实验用新鲜肝糜与丁酸保温，生成的丙酮可 用碘仿反应测定。在碱性的条件下，丙酮与碘 生成碘仿。反应式如下：
2NaOH+I2→NaIO+NaI+H2O
CH3COCH3+3NaOI→CHI3+CH3COONa+2NaOH
碘仿
剩余的碘，可用标准硫代硫酸钠滴定。
NaOI+NaI+2HCl→I2+2NaCI+H2O I2+2Na2S2O3→Na2S4O6+2NaI
(8) 标准丙氨酸溶液(0.1%)
(9) 标准谷氨酸溶液(0.1%)
(10)0.1%水合茚三酮乙醇溶液
(11)酚溶剂：在大烧杯中，加蒸馏水40ml，再 加入新蒸馏的无色的苯酚150g。在水浴中加热 搅拌，混合至酚完全溶解。将该溶液倒入盛有 100ml蒸馏水的500ml分液漏斗内，轻轻振荡 混合，使其成为乳状液。静置7-10h，乳状液 变成两层透明的溶液，下层为被水饱和的酚溶 液（即酚溶剂），放出下层，贮存在棕色试剂 瓶中备用。
试剂和器材
1. 试剂 (1) 实验动物----家兔 (2) 1/15mol/L磷酸缓冲液（pH=7.4） (3) 1%谷氨酸溶液（用KOH中和至中性） (4) 1%丙酮酸溶液（用KOH中和至中性） (5) 0.1%碳酸氢钾溶液 (6) 0.05%碘乙酸溶液 (7)15%三氯醋酸溶液
根据滴定样品与滴定对照所消耗的硫代硫酸钠 之差，可以计算由丁酸氧化生成丙酮的量。
试剂和器材
1. 材料
动物：家兔
生物化学实验
(代谢部分)
实验一 氨基转移反应的定性鉴 定
实验目的
1. 学习一种鉴定氨基移换作用的简便方 法及其原理；
2. 进一步掌握纸层析的原理和操作技术； 3. 了解氨基移换作用在中间代谢中的意
义。
实验原理
氨基移换酶也称转氨酶,它能催化α-氨基酸的 氨基与α-酮酸的α-酮基互换，这种作用称为氨 基移换作用。它在生物体内蛋白质的合成与分 解等中间代谢中，在糖、脂肪、蛋白质三类物 质代谢的相互联系、相互转化上，都起着很重 要的作用。任何一种氨基酸进行转氨作用时， 都由其专一的转氨酶催化。它们的最适pH接 近7.4。在各种转氨酶中，以谷氨酸—草酰乙 酸转氨酶（简称谷草转氨酶、GOT）及谷氨 酸—丙酮酸转氨酶（简称谷丙转氨酶、GPT） 活力最强。它们催化的反应如下：
氨基酸与茚三酮反应，在滤纸上呈现紫红色斑 点。
实验二 脂肪酸的β-氧化
实验目的
1.了解脂肪酸的β-氧化作用； 2. 通过测定和计算反应液内丁酸氧化生
成丙酮的量，掌握测定β-氧化作用的方 法及其原理。
实验原理
根据β—氧化学说，机体组织能将脂肪酸氧化 生成乙酰辅酶A。两分子乙酰辅酶A可再缩合 成乙酰乙酸。在肝脏内，乙酰乙酸可脱羧生成 丙酮，也可还原生成β-羟丁酸。乙酰乙酸、β羟丁酸和丙酮总称为酮体。酮体为机体代谢的 中间产物。在正常情况下，其产量甚微；患糖 尿病或食用高脂肪膳食时，血中酮体含量增高， 尿中也能出现酮体。
3.纸上层析法检查
两人合用一张滤纸(宽15cm，长20cm)， 在其一端距边缘1.5cm处，用铅笔轻画一 条与纸边平行的直线做为层析基线，在 基线上每隔2cm用铅笔点一小点，共8点， 点外画一半径为1.5mm的小圆圈。如图 所示：
每人4个点（标准丙氨酸溶液、标准谷氨酸溶 液、对照上清液、样品上清液）。点样时，将 毛细管口轻轻触到滤纸上，使每种溶液分别形 成直径为2-3mm的圆斑，每次点样后，自然风 干或吹风机吹干，再点下一次，重复3-4次， 点样量应均匀相等。完成点样后，将滤纸卷成 圆筒，用线将两端缝合，并留一宽缝，以免接 触产生毛细现象。缝好后放入层析罩内。
上述两种酶均广泛存在于生物机体中，在正常 人血清中也有少量存在。机体发生肝炎、心肌 梗塞病变时，血清中转氮酶活力显著增加，在 临床上转氨酶活性的测定有重要意义。测定转 氨酶活性的方法很多，如分光光度法，纸上层 析法及光电比色法等。
本实验利用纸层析法，检查由谷氨酸和丙酮酸 在谷丙转氨酶的作用下所生成的丙氨酸，证明 组织内氨基移换作用。为了防止丙酮酸被组织 中其它酶所氧化或还原，可加碘乙酸或溴乙酸 抑制酵解作用或氧化作用。
用被酚所饱和的水溶液，平衡20min后，用带 小漏斗的玻璃管从层析罩上加饱合酚试剂25ml 于层析缸内。然后，立即盖紧塞子，当溶剂前 沿达到距滤纸上端约2.5cm处，取出滤纸，晾 干或吹干，以除去酚溶剂，用喷雾器向滤纸均 匀喷洒0.1%茚三酮乙醇溶液，放入60-80℃烘 箱中显色10-15min。
烧杯。 针、线、喷雾器。
操作方法
1. 酶液的制备 将兔击晕，பைடு நூலகம்速解剖，取出肝脏，在低
温条件下剪碎。用表面皿称取1.5g肝脏， 放入匀浆器中，再加入3ml磷酸缓冲液。 研成匀浆后，倒入离心管中，在 2500r/min的条件下，离心5min，取上清 液，即为制备的酶液。
2.体外氨基移换反应
取2支试管，编号。向1号试管中加入15%三氯 醋酸溶液10滴和酶液10滴，混匀，静置15min， 做对照管。向2号试管中加入酶液10滴，然后 向1、2号试管中各加入1%谷氨酸溶液10滴、 1%丙酮酸溶液10滴、0.1%碳酸氢钾溶液10滴 和 0.05% 碘 乙 酸 溶 液 5 滴 ， 混 匀 ， 放 入 37℃40℃恒温水浴中保温1.5-2h。在保温过程中， 将试管摇荡几次。保温完毕后取出试管，立即 向第2号试管中加入15%三氯醋酸溶液10滴以 沉淀蛋白质终止酶反应。将2支试管的内容物 分别离心，2500r/min,5min。将上清液转移到 试管中，用塞塞紧放置于低温处备用。