高中生物第章发酵工程第节发酵工程的无菌技术第课时发酵工程的灭菌方法设备和器具教师用书苏教版选择性必修

第二节发酵工程的无菌技术第1课时发酵工程的灭菌方法、设备和器具课标内容要求核心素养对接
1.阐明在发酵工程中灭菌是获得纯净的微生物培养物的前提。

2.阐明无菌技术是在操作过程中，保持无菌物品与无菌区域不被微生物污染的技术。

生命观念：掌握常用的灭菌方法及特点、灭菌设备及器具的使用方法，认同无菌技术在微生物培养中的重要作用。

科学思维：根据灭菌对象及实验要求选择正确的灭菌方法、设备及器具。

社会责任：培养有菌意识，养成良好的个人生活习惯，积极维护公共卫生。

一、发酵工程的灭菌方法
1．无菌技术
(1)定义：在操作过程中，保持物品与操作区域的无菌状态并不被微生物污染的技术。

(2)核心：灭菌。

2．灭菌方法、原理及应用
灭菌方法原理应用(特点)
化学试剂灭菌法甲醛、氯、高锰酸钾等化学试剂能
破坏微生物的蛋白质或细胞结构，
具有杀菌作用
不用于培养基的灭菌(灭菌剂可能
会与培养基中的一些成分发生作
用)
射线灭菌法利用紫外线、X射线、γ射线等产
生的高能粒子进行灭菌
一般用于表面和空气的灭菌(射线
的穿透力弱)
干热灭菌法利用干热空气灭菌(干热空气灭菌
法)；利用火焰灼烧灭菌(火焰灼烧
法)
干热空气灭菌法主要用于要求保持
干燥的实验器具；火焰灼烧法常用
于接种等操作过程
湿热灭菌法利用饱和蒸汽进行灭菌，蒸汽的穿
透力大，与较低温的物体表面接触
时可放出大量能量，菌体蛋白质易
凝固
培养基及容器的灭菌；相同温度下
湿热灭菌比干热灭菌更有效
过滤除菌法通过过滤阻留微生物从而达到除菌
目的
大量制备无菌空气；产品提取过程
中用于处理料液获得无菌产品
1．电热鼓风干燥箱
(1)适用对象：空的玻璃器皿(如培养皿、离心管、移液管)、金属用具(如镊子、手术刀)和其他耐高温的物品(如菌种保藏采用的沙土管、石蜡油、碳酸钙)的灭菌。

不适用于带有胶皮或塑料的物品、液体及固体培养基的灭菌。

(2)优点：使灭菌器皿保持干燥。

(3)灭菌标准：一般以能否杀死细菌的芽孢作为彻底灭菌的标准，温度需提高到约160 ℃，加热2～3 h。

(4)注意安全事项：不得将易腐、易燃、易爆物品放入箱内干燥灭菌；干燥箱工作时，必须将风机开关打开，否则会导致电机或传感器烧坏；箱内经常保持清洁，长期不用应套好防尘罩，放置在干燥的室内等。

2．高压蒸汽灭菌锅
(1)灭菌原理：在一个密闭的锅内，水的沸点随蒸汽压力的增高而上升，加压的同时提高蒸汽的温度，使锅内的待灭菌物品在一定压力和温度等条件下，杀死其中所有微生物的营养体及其芽孢。

(2)类型：手动式高压蒸汽灭菌锅和全自动高压蒸汽灭菌锅。

(3)注意事项：操作人员必须在现场规范操作，严格控制热源维持灭菌时的压力。

锅内压力过高，不仅培养基的营养成分会被破坏，而且高压锅超过耐压范围后可能会发生爆炸，造成伤人事故等。

(4)高压蒸汽灭菌锅的使用步骤
加水(加水的量不可过少，防止灭菌锅烧干)
↓
装锅(灭菌桶至少留1/3空间，盖好锅盖，对称的旋紧锅盖四周的固定螺栓)
↓
加热
↓
排空冷空气(加热后，随着锅内压力逐渐增加，须打开排气阀，排出锅内残留的冷空气。

当压力表指针回降到“0”时，关闭气阀，继续加热)
↓
保温保压(锅内压力升至约103 kPa、温度达到121 ℃，维持15～20 min)
↓
出锅(压力表指针降至“0”点，待温度下降后，打开排气阀，旋开固定螺栓，开盖，取出灭菌物品)
3．空气除菌设备
(1)适用对象：空气除菌是好氧发酵的关键环节，发酵工程中常采用空气过滤除菌的方法来净化所需空气。

(2)原理：让含菌空气通过无菌干燥的过滤介质，以阻截空气中所含微生物。

(3)不同发酵过程对空气无菌程度的要求：不同发酵过程对空气无菌程度的要求不同，例如，酵母菌繁殖速度快，对空气的无菌要求相对较低，制备氨基酸、抗生素等的发酵过程，所需的微生物对空气无菌的要求较高。

三、发酵工程的无菌操作器具
1．接种器具
(1)接种的概念：在无菌条件下将微生物接入培养基的操作过程。

(2)常用的接种器具：玻璃涂布器、接种针、接种环等。

(3)应用
①玻璃涂布器用于平板稀释涂布接种。

②接种针用于穿刺接种。

③接种环用于斜面接种或在平板培养基上划线接种。

2．转移器具
(1)移液管：用来准确移取一定体积的溶液或分装化学试剂的量器，一般用于转移部分液体培养物、系列稀释微生物或分装化学试剂。

(2)刻度移液管：具有刻度的直形玻璃管。

在需要控制试剂加入量时，一般使用刻度移液管。

(3)使用要点
①用拇指及中指捏住管颈标线以上的地方，将移液管插入待取溶液液面下约1 cm。

(注意：移液管不应伸入太多，以免管尖外壁粘有过多溶液；也不应伸入太少，以免液面下降后而吸空。

)
②一手拿着橡皮吸球轻轻将溶液吸上，眼睛注视正在上升的液面位置。

当液面上升到刻度标线以上约1 cm处时，迅速用另一只手食指堵住管口，取出移液管。

③用滤纸条拭干移液管下端外壁，并使其与地面垂直，稍微松开手食指，使液面缓缓下降，此时，视线应平视标线，直到弯月状液面下端与标线相切，立即用食指按紧管口，使液体不再流出，并使出口尖端接触容器外壁，以除去尖端外的残留溶液。

④将移液管移入准备接受溶液的容器中时，使其出口尖端接触器壁；将容器微倾斜，而使移液管直立；然后放松食指，使溶液自由地顺壁流下；待溶液停止流出后将移液管移出。

(4)微量取液器：微量取液器分为固定容量的和可调容量的两种。

3．超净工作台：是一种经过空气净化而形成高洁净操作环境的设备。

(1)净化原理：利用工作台内紫外线灯的杀菌作用，并通过空气过滤器过滤确保工作台内空气的无菌、无污染。

(2)使用方法：开机杀菌30 min后，关掉紫外线灯，约10 min后使用超净工作台。

(3)优点：操作方便。

判断对错(正确的打“√”，错误的打“×”)
1．获得纯净微生物培养物的关键是防止杂菌污染。

( ) [答案] √
2．用于微生物培养的器皿、接种用具和培养基都要进行消毒。

( ) ×提示：用于微生物培养的器皿、接种用具和培养基都要进行灭菌。

3．培养基分装到培养皿后进行灭菌。

( )
×提示：培养基分装到培养皿之前要进行灭菌。

4．无菌操作的对象只要是没有生物活性的材料，都可采用干热灭菌法进行灭菌。

( )
×提示：培养基一般使用高压蒸汽灭菌法，不能使用干热灭菌法灭菌。

5．高压蒸汽灭菌锅装锅后须依次旋紧锅盖四周的固定螺栓。

( ) ×提示：盖好锅盖后应对称旋紧固定螺栓。

6．为保持超净工作台高洁净操作环境，应保持紫外线灯常开。

( ) ×提示：紫外线灯发出的射线及形成的臭氧分子对人体有害，应关闭10 min后方可使用超净工作台。

常用灭菌和消毒方法的比较
1．常用消毒方法
常用消毒方法主要方法应用范围
煮沸消毒法100 ℃煮沸5～6 min 家庭餐具等生活用品
巴氏消毒法62～65 ℃煮30 min或80～90 ℃
煮30 s～1 min
牛奶、啤酒、果酒和酱油等不宜进
行高温灭菌的液体
紫外线消毒法30 W紫外灯照射30 min 接种室空气
化学药物消毒法用体积分数为70%～75%的乙醇、碘
酒涂抹，来苏尔喷洒等
皮肤、伤口、动植物组织表面和空
气、手术器械、塑料或玻璃器皿等
合作探究：(1)无菌技术除了用来防止实验室的培养物被其他外来微生物污染外，还有什么作用？
提示：无菌技术还能有效避免操作者被微生物感染。

(2)对培养基、培养皿、接种环、实验者的双手、空气和牛奶常采用的灭菌或消毒方法分别是什么？
提示：分别为高压蒸汽灭菌、干热灭菌、灼烧灭菌、化学药物消毒、紫外线消毒、巴氏消毒。

(3)用于生物消毒的微生物具有什么特点？
提示：用于生物消毒的微生物能产生杀死其他微生物的代谢产物或是寄生性的微生物。

1．下列关于灭菌和消毒的说法不正确的是( )
A．灭菌是指杀死环境中的所有微生物，包括芽孢和孢子
B．灭菌和消毒实质上是相同的
C．接种环用灼烧法灭菌
D．常用的灭菌方法有灼烧灭菌、干热灭菌、湿热灭菌等
B[灭菌与消毒的实质是不同的。

灭菌是指杀死一定环境中的所有微生物，包括芽孢和孢子，使用的是较为强烈的理化因素，常用的灭菌方法有灼烧灭菌、干热灭菌、湿热灭菌等，根据不同的材料选用不同的灭菌方法，如接种环的灭菌用灼烧法；消毒是指杀死物体表面或内部的部分微生物(不包括芽孢和孢子)，使用的是较为温和的物理或化学方法。

] 2．在生产、生活和科研实践中，经常通过消毒和灭菌来避免杂菌的污染。

请回答下列问题：
(1)在实验室中，玻璃和金属材质的实验器具________(填“可以”或“不可以”)放入干热灭菌箱中进行干热灭菌。

(2)牛奶的消毒常采用巴氏消毒法或高温瞬时消毒法，与煮沸消毒法相比，这两种方法的优点是__________________________________________________
_______________________________________________________________。

(3)密闭空间内的空气可采用紫外线照射消毒，其原因是紫外线能_______
______。

在照射前，适量喷洒________，可强化消毒效果。

(4)水厂供应的自来水通常是经过________(填“氯气”“乙醇”或“高锰酸钾”)消毒的。

(5)某同学在使用高压蒸汽灭菌锅时，若压力达到设定要求，而锅内并没有达到相应温度，最可能的原因是________________________________________
________________________________________________________________
_______________________________________________________________。

[解析] (1)在实验室中，能耐高温的、需要保持干燥的物品，如玻璃器皿和金属材质的实验器具等可以放入干热灭菌箱中进行干热灭菌。

(2)巴氏消毒法或高温瞬时消毒法与煮沸消毒法相比，其优点表现为在达到消毒目的的同时，营养物质损失较少。

(3)紫外线照射能消毒的原因是其能够破坏微生物细胞中的DNA分子。

在利用紫外线照射前，适量喷洒石炭酸或煤酚皂溶液等消毒液，可强化消毒效果。

(4)自来水通常是采用氯气进行消毒的。

(5)采用高压蒸汽灭菌时，若压力达到设定要求，而温度未达到相应要求，最可能的原因是没有排尽高压蒸汽灭菌锅内的冷空气。

[答案] (1)可以(2)在达到消毒目的的同时，营养物质损失较少(3)破坏DNA结构消毒液(4)氯气(5)未将锅内冷空气排尽
(1)酒精消毒液中酒精浓度对效果的影响：70%的酒精杀菌效果最好。

原因是浓度过高，菌体表面蛋白质变性过快而凝固成一层保护膜，酒精不能渗入其中；浓度过低，杀菌能力减弱。

(2)无菌技术措施的选择原则
①考虑效果：灭菌的效果比消毒要好。

②考虑操作对象的承受能力：活体生物材料、操作者的手等只能采用消毒的方法，而不能采用灭菌的方法。

[课堂小结]
知识网络构建核心语句背诵
发酵工程中的无菌技术⎩⎪⎪⎪⎪⎨⎪⎪⎪⎪⎧灭菌方法⎩⎪⎨⎪⎧化学试剂灭菌法射线灭菌法干热灭菌法湿热灭菌法过滤除菌法灭菌设备⎩⎪⎨⎪⎧电热鼓风干燥箱高压蒸汽灭菌锅空气除菌设备无菌操作的器具⎩⎪⎨⎪⎧接种器具⎩⎪⎨⎪⎧玻璃涂布器接种针接种环转移器具⎩⎪⎨⎪⎧移液管微量取液器超净工作台 1.无菌技术是指在操作过程中，保持
物品与操作区域的无菌状态并不被
微生物污染的技术，其核心是灭菌。

2.常用的灭菌技术包括化学试剂灭
菌法(甲醛、氯、高锰酸钾)、射线灭
菌法(紫外线等)、干热灭菌法(干热
空气灭菌法和火焰灼烧法)、湿热灭
菌法(高压蒸汽灭菌法)和过滤除菌
法。

3.发酵工程中的灭菌设备有电热鼓
风干燥箱、高压蒸汽灭菌锅和空气除
菌设备。

4.在无菌条件下将微生物接入培养
基的操作过程称为接种。

玻璃涂布器
用于平板稀释涂布接种，接种针用于
穿刺接种，接种环用于斜面接种或在
平板培养基上划线接种。

5.超净工作台是一种经过空气净化
而形成高洁净操作环境的设备。

其净
化原理是利用工作台内紫外线灯的
杀菌作用，并通过空气过滤器过滤确
保工作台内空气的无菌、无污染。

1．采用干热灭菌、灼烧灭菌、高压蒸汽灭菌、紫外线照射等几种方法，可分别杀死哪些部位的杂菌( )
A ．接种环、吸管、培养基、接种室
B ．吸管、接种环、培养基、接种箱
C ．培养基、吸管、接种环、接种箱
D ．培养皿、吸管、培养基、双手
B [干热灭菌是将灭菌物品放入干热灭菌箱内，在140～160 ℃下加热2～3 h ，适用于耐高温且需要保持干燥的物品，如玻璃器皿(吸管、培养皿)和金属用具等；灼烧灭菌是利用酒精灯火焰的充分燃烧层灭菌，如接种针、接种环等；高压蒸汽灭菌用高压蒸汽灭菌锅，一般在压力为103 kPa 、温度为121 ℃的条件下，维持15～20 min ，主要用于培养基灭菌；
紫外线照射适用于物体表面灭菌和空气灭菌，如接种室、接种箱、超净工作台等，使用前用紫外线照射约30 min。

]
2．微生物培养过程中，要十分重视无菌操作，现代生物学实验中的许多方面也要进行无菌操作，防止杂菌污染，请分析下列操作中错误的是( )
①煮沸消毒可以杀死微生物细胞和一部分芽孢
②接种操作要在酒精灯火焰附近进行
③家庭制作葡萄酒时要将容器和葡萄进行灭菌
④培养基要进行高压蒸汽灭菌
⑤加入培养基中的指示剂或染色剂不需要灭菌
A．①②B．②④C．②⑤D．③⑤
D[煮沸可以杀死微生物细胞和一部分芽孢，属于消毒，①正确；为防止空气中杂菌污染，接种时要在酒精灯火焰附近进行，②正确；家庭制作葡萄酒时所利用的微生物是葡萄表面的野生型酵母菌，故不能对葡萄进行灭菌，③错误；培养基灭菌常用高压蒸汽灭菌法，④正确；加入培养基中的指示剂或染色剂均需灭菌处理，⑤错误。

]
3．下列关于高压蒸汽灭菌锅的使用方法中，错误的是( )
A．使用高压蒸汽灭菌锅时，需等锅内的冷空气排尽后再关闭排气阀
B．培养基常用高压蒸汽灭菌法处理
C．灭菌结束后，需迅速将排气阀打开，等压力表降为“0”时再取出培养基
D．灭菌前一般需要将锥形瓶的棉塞用牛皮纸或报纸包扎好
C[使用高压蒸汽灭菌锅时，需等锅内的冷空气排尽后再关闭排气阀，A正确；培养基常用高压蒸汽灭菌法处理，B正确；灭菌结束后，让灭菌锅内温度自然下降，等压力表降为“0”时再取出培养基，C错误；灭菌前一般需要将锥形瓶的棉塞用牛皮纸或报纸包扎好，D 正确。

]
4．下列关于消毒和灭菌的说法，错误的是( )
A．人们常用化学药剂对水源和双手进行消毒
B．接种室和超净工作台可用紫外线进行消毒
C．培养基转移到锥形瓶后可以采用干热灭菌
D．接种环可在火焰充分燃烧层进行灼烧灭菌
C[用酒精擦拭双手进行消毒；用氯气消毒水源，A正确；接种室和超净工作台等表面消毒，可用紫外线进行消毒，B正确；培养基转移到锥形瓶后可以采用高压蒸汽灭菌，C错误；接种环可在火焰充分燃烧层进行灼烧灭菌，D正确。

]
5．下列关于空气除菌设备的说法不正确的是( )
A．空气中含有大量的灰尘颗粒和各种杂菌
B．发酵工程中常采用空气过滤除菌的方法净化空气
C．不同的发酵过程，对空气无菌程度的要求相同
D．过滤除菌法并不能将空气中的微生物杀死
C[不同的发酵过程，对空气无菌程度的要求不同。

如酵母菌繁殖速度快，对空气的无菌程度要求较低，而制备抗生素等的发酵过程，所需的微生物对空气无菌的程度要求较高。

]。