赖氨酸对奶牛乳腺上皮细胞内乳蛋白合成相关基因表达和蛋白磷酸化的影响

动物营养学报２０１８ꎬ３０(８):３１４２￣３１５０ＣｈｉｎｅｓｅＪｏｕｒｎａｌｏｆＡｎｉｍａｌＮｕｔｒｉｔｉｏｎ
㊀
ｄｏｉ:１０.３９６９/ｊ.ｉｓｓｎ.１００６￣２６７ｘ.２０１８.０８.０３２
赖氨酸对奶牛乳腺上皮细胞内乳蛋白合成相关
基因表达和蛋白磷酸化的影响
陈㊀璐㊀赵艳丽㊀郭晓宇㊀史彬林㊀闫素梅∗
(内蒙古农业大学动物科学学院ꎬ呼和浩特０１００１８)
摘㊀要:本试验旨在研究赖氨酸(Ｌｙｓ)对奶牛乳腺上皮细胞(ＢＭＥＣｓ)内乳蛋白合成相关基因表达和蛋白磷酸化的影响ꎬ深入探讨Ｌｙｓ对乳蛋白合成影响的机理ꎮ将第３代ＢＭＥＣｓ随机分为６组ꎬ各组培养基中Ｌｙｓ的浓度分别为０.５(对照)㊁１.０㊁２.０㊁４.０㊁８.０和１６.０ｍｍｏｌ/Ｌꎬ每组６个重复ꎮ３７ħ㊁５％ＣＯ２培养４８ｈꎬ之后采用化学发光法测定ＢＭＥＣｓ内三磷酸腺苷(ＡＴＰ)的含量ꎬ采用实时荧光定量ＰＣＲ法测定乳蛋白合成相关基因表达量以及采用蛋白质免疫印迹法测定乳蛋白合成相关蛋白的磷酸化水平ꎮ结果表明:随着Ｌｙｓ浓度的增加ꎬＡＴＰ含量呈趋于显著的二次曲线升高(Ｐ＝０.０５０)ꎻκ－酪蛋白(ＣＳＮ３)(Ｐ＝０.０９３)㊁哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(ｍＴＯＲ)(Ｐ＝０.００５)㊁真核起始因子４Ｅ(ｅＩＦ４Ｅ)(Ｐ＝０.０７６)和磷酸腺苷活化的蛋白激酶α１(ＡＭＰＫα１)基因表达量(Ｐ＝０.０４５)呈显著或趋于显著的二次曲线变化ꎬ均为先升高后降低ꎻα－酪蛋白(ＣＳＮ１Ｓ１)基因表达量(Ｐ＝０.０８１)及ｍＴＯＲ(Ｐ＝０.０３８)和ｐ７０核糖体蛋白Ｓ６激酶１(Ｓ６Ｋ１)磷酸化水平(Ｐ＝０.０２２)呈显著或趋于显著的一次线性降低ꎻ磷酸腺苷活化的蛋白激酶(ＡＭＰＫ)的磷酸化水平呈显著的一次线性升高(Ｐ＝０.０１４)ꎮ方差分析结果显示ꎬ添加Ｌｙｓ显著影响ＡＴＰ含量㊁乳蛋白合成相关基因表达量及ｅＩＦ４Ｅ磷酸化水平(Ｐ<０.０５)ꎬ其中ꎬＡＴＰ含量以２.０~１６.０ｍｍｏｌ/Ｌ组ꎬＣＳＮ１Ｓ１㊁β－酪蛋白(ＣＳＮ２)㊁信号转导和转录激活因子５(ＳＴＡＴ５)基因表达量以１.０~２.０ｍｍｏｌ/Ｌ组ꎬｍＴＯＲ基因表达量以１.０~８.０ｍｍｏｌ/Ｌ组ꎬＣＳＮ３基因表达量以１.０~４.０ｍｍｏｌ/Ｌ组ꎬ酪氨酸激酶２(ＪＡＫ２)基因表达量以１.０~１６.０ｍｍｏｌ/Ｌ组ꎬＳ６Ｋ１基因表达量以２.０ｍｍｏｌ/Ｌ组ꎬｅＩＦ４Ｅ基因表达量以２.０~８.０ｍｍｏｌ/Ｌ组ꎬｅＩＦ４Ｅ磷酸化水平以２.０~４.０ｍｍｏｌ/Ｌ组时促进效果较好ꎬ但１６.０ｍｍｏｌ/Ｌ组ＣＳＮ１Ｓ１㊁ＣＳＮ３㊁ＳＴＡＴ５及ｍＴＯＲ基因表达量受到抑制ꎬ１.０~１６.０ｍｍｏｌ/Ｌ组真核起始因子４Ｅ结合蛋白１(４ＥＢＰ１)基因表达量受到抑制ꎮ总之ꎬＬｙｓ浓度为１.０~２.０ｍｍｏｌ/Ｌ时ꎬ对ＢＭＥＣｓ内乳蛋白合成相关基因表达的促进效果较好ꎮ关键词:奶牛ꎻ乳腺上皮细胞ꎻ赖氨酸ꎻ乳蛋白
中图分类号:Ｓ８２３㊀㊀㊀㊀文献标识码:Ａ㊀㊀㊀㊀文章编号:１００６￣２６７Ｘ(２０１８)０８￣３１４２￣０９收稿日期:２０１８－０１－２５
基金项目:国家奶业 ９７３计划 项目(２０１１ＣＢ１００８００３)
作者简介:陈㊀璐(１９９０ )ꎬ女ꎬ山西襄汾人ꎬ硕士研究生ꎬ从事奶牛营养研究ꎮＥ￣ｍａｉｌ:１５１０５６０６７１＠ｑｑ.ｃｏｍ∗通信作者:闫素梅ꎬ教授ꎬ博士生导师ꎬＥ￣ｍａｉｌ:ｙａｎｓｍｉｍａｕ＠１６３.ｃｏｍ
㊀㊀乳蛋白是牛奶的主要成分ꎬ是评价牛奶质量的重要指标ꎮ氨基酸(ａｍｉｎｏａｃｉｄꎬＡＡ)是合成乳蛋白的主要前体物ꎬ可以影响乳蛋白合成[１]ꎮ赖氨酸(ｌｙｓｉｎｅꎬＬｙｓ)是乳蛋白合成主要的必需氨基酸(ｅｓｓｅｎｔｉａｌａｍｉｎｏａｃｉｄꎬＥＡＡ)ꎬ也是奶牛的限制性
氨基酸ꎮ因此ꎬ深入研究Ｌｙｓ对乳蛋白合成的影响及机理ꎬ对调节乳腺内乳成分的合成和改善乳品质具有重要意义ꎮ李沐阳等[２]研究发现ꎬ玉米秸秆饲粮条件下奶牛阴外动脉灌注氨基酸能促进乳蛋白合成ꎮ王立娜[３]以奶牛乳腺上皮细胞(ｂｏ￣
８期陈㊀璐等:赖氨酸对奶牛乳腺上皮细胞内乳蛋白合成相关基因表达和蛋白磷酸化的影响
ｖｉｎｅｍａｍｍａｒｙｅｐｉｔｈｅｌｉａｌｃｅｌｌｓꎬＢＭＥＣｓ)为模型在培养基中添加ＥＡＡ发现ꎬ乳蛋白的合成量增加了ꎮＧｉａｌｌｏｎｇｏ等[４]研究发现ꎬ奶牛灌注过瘤胃Ｌｙｓ后促进乳蛋白合成的同时ꎬ也改善了乳品质ꎮ可见ꎬＬｙｓ在一定程度上影响了乳蛋白的合成ꎬ但前人的研究多集中在向奶牛体内灌注Ｌｙｓ影响乳蛋白合成的方面ꎬ对体外添加Ｌｙｓ影响乳蛋白合成及其机理方面的探索研究甚少ꎬ有必要对此进行深入试验研究ꎮ鉴于此ꎬ本研究以ＢＭＥＣｓ为模型ꎬ研究不同浓度Ｌｙｓ对乳蛋白合成相关基因表达和蛋白磷酸化的影响ꎬ为进一步探讨Ｌｙｓ对ＢＭＥＣｓ内乳蛋白合成的影响机理提供理论基础ꎮ
１㊀材料与方法
１.１㊀主要试剂与仪器
㊀㊀Ⅱ型胶原酶㊁ＤＭＥＭ/Ｆ１２培养基㊁胰岛素转铁蛋白硒钠㊁胎牛血清㊁０.２５％胰蛋白酶/乙二胺四乙酸(ＥＤＴＡ)购自Ｇｉｂｃｏ公司ꎻＬｙｓ(货号Ｌ８６６２)㊁氢化可的松㊁表皮生长因子㊁催乳素㊁琼脂糖购自Ｓｉｇ￣ｍａ公司ꎻＲＮＡｉｓｏＰＬＵＳ㊁ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔＲＴＭａｓｔｅｒＭｉｘ和ＳＹＢＲＰｒｅｍｉｘＥｘＴａｑＴＭⅡ购自ＴａＫａＲａ公司ꎻ兔抗哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(ｍａｍｍａｌｉａｎｔａｒｇｅｔｏｆｒａｐａｍｙｃｉｎꎬｍＴＯＲ)抗体(货号ａｂ２７３２)㊁兔抗磷酸化ｍＴＯＲ抗体(货号ａｂ８４４００)㊁兔抗真核起始因子４Ｅ(ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃｉｎｉｔｉａｔｉｏｎｆａｃｔｏｒ４ＥꎬｅＩＦ４Ｅ)抗体(货号ａｂ７２１１６)㊁兔抗磷酸化ｅＩＦ４Ｅ抗体(货号ａｂ４７７４)㊁兔抗ｐ７０核糖体蛋白Ｓ６激酶１(ｒｉｂｏｓｏ￣ｍａｌｐｒｏｔｅｉｎＳ６ｋｉｎａｓｅ１ꎬＳ６Ｋ１)抗体(货号ａｂ６４８０４)㊁兔抗磷酸化Ｓ６Ｋ１抗体(货号ａｂ１２６８１８)㊁兔抗真核起始因子４Ｅ结合蛋白１(ｅｕ￣ｋａｒｙｏｔｉｃｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ４Ｅｂｉｎｄｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎ１ꎬ４ＥＢＰ１)抗体(货号ａｂ２６０６)㊁兔抗磷酸化４ＥＢＰ１抗体(货号ａｂ７５７６７)购自Ａｂｃａｍ公司ꎻ兔抗磷酸腺苷活化的蛋白激酶α１(ａｄｅｎｏｓｉｎｅ５ ￣ｍｏｎｏ￣ｐｈｐｓｐｈａｔｅ￣ａｃｔｉｖｅｐｒｏｔｅｉｎｋｉｎａｓｅꎬＡＭＰＫα１)抗体(货号ＹＴ０２１６)和兔抗磷酸化ＡＭＰＫα１抗体(货号ＹＰ０５７５)购自Ｉｍ￣ｍｕｎｏｗａｙ公司ꎻ一抗稀释液㊁二抗稀释液㊁十二烷基四乙酸二钠(ＳＤＳ)－聚丙烯酰胺凝胶电泳(ＰＡＧＥ)电泳液㊁转膜液㊁ＥＣＬ化学超敏显色液购自北京碧云天公司ꎻ辣根过氧化物酶(ＨＲＰ)标记山羊抗兔二抗(货号０４－１５－０６)购自ＫＰＬ公司ꎮ主要仪器:全自动酶标仪(ＳｙｎｅｒｇｙＨ４ꎬ美国ＢｉｏＴｅｋ)㊁实时荧光定量ＰＣＲ仪(ＡＢＩ－７５００ꎬ美国ＡＢＩ)㊁电泳仪㊁转膜仪㊁蛋白成像系统(美国ＢＩＯ￣ＲＡＤ)ꎮ
１.２㊀原代ＢＭＥＣｓ的体外培养与试验设计
㊀㊀在内蒙古自治区呼和浩特市北亚清真屠宰场选取３头３~５岁经产的健康泌乳中期的高产荷斯坦奶牛乳腺组织ꎬ参考Ｓｈｅｎｇ等[５]采用的胶原酶消化法获得和培养ＢＭＥＣｓꎬ当原代细胞贴壁率达到８０％~９０％后ꎬ用０.２５％胰蛋白酶/ＥＤＴＡ对细胞进行纯化和传代ꎮ将第３代ＢＭＥＣｓ按照试验要求的细胞密度接种于不同细胞培养板上ꎬ于３７㊁５％ＣＯ２条件下培养２４ｈꎮ当细胞贴壁率达到８０％~９０％时ꎬ换为饥饿培养基ꎬ培养１２ｈ后ꎬ采用单因素完全随机试验设计ꎬ将细胞分为６组ꎬ在每组中加入不同浓度的Ｌｙｓ工作液ꎬ使反应体系中Ｌｙｓ终浓度分别为０.５(对照)㊁１.０㊁２.０㊁４.０㊁８.０和１６.０ｍｍｏｌ/Ｌꎬ每组６个重复ꎬ培养４８ｈꎮＤＭＥＭ/Ｆ１２培养基中Ｌｙｓ的浓度为０.５ｍｍｏｌ/ＬꎬＬｙｓ的浓度参考高海娜[６]和李喜艳[７]的研究结果ꎬ并通过测定细胞相对增殖率[相对增殖率(％)＝(试验组ＯＤ４９０ｎｍ/对照组ＯＤ４９０ｎｍ)ˑ１００]确定ꎮ
１.３㊀测试指标与方法
㊀㊀ＢＭＥＣｓ内ＡＴＰ的含量采用化学发光法测定ꎮ将细胞以５ˑ１０５个/孔的密度接种于６孔培养板上ꎬ按试验设计培养结束后ꎬ弃上清ꎬ每孔加入２００μＬ裂解液ꎬ待细胞充分裂解后ꎬ收集细胞悬液ꎬ４ħ㊁１５４５５ˑｇ离心５ｍｉｎꎬ取上清ꎬ立即根据ＡＴＰ检测试剂盒说明书的方法进行测定ꎬ即用ＡＴＰ检测裂解液将ＡＴＰ标准溶液稀释为０.０１㊁０.０３㊁０.１０㊁０.３０㊁１.００㊁３.００和１０.００μｍｏｌ/Ｌ６个浓度ꎻ然后ꎬ用ＡＴＰ检测试剂稀释液将ＡＴＰ检测试剂按１ʒ９的比例稀释成ＡＴＰ检测工作液ꎻ最后ꎬ在每个检测孔内加入１００μＬＡＴＰ检测工作液ꎬ室温静置３~５ｍｉｎꎬ再向每孔内加入２０μＬ样品ꎬ迅速混匀后用全自动酶标仪测定Ｌｕｍ值ꎬ再根据标准曲线计算出样品ＡＴＰ浓度ꎬ用二辛可酸(ＢＣＡ)蛋白质浓度试剂盒测样品中蛋白质浓度ꎬ将ＡＴＰ浓度换算成ｎｍｏｌ/ｍｇｐｒｏｔ形式ꎮ
㊀㊀ＢＭＥＣｓ内总ＲＮＡ按照Ｔｒｉｚｏｌ法提取ꎮ将细胞以５ˑ１０５个/孔的密度接种于６孔培养板ꎬ按试验设计培养结束后ꎬ用酶标仪检测总ＲＮＡ的纯度与浓度ꎬＯＤ２６０ｎｍ/ＯＤ２８０ｎｍ在１.８~２.２表示提取的ＲＮＡ纯度较好ꎮ总ＲＮＡ完整性用２％琼脂糖凝胶电泳检测ꎮ将总ＲＮＡ反转录成ｃＤＮＡꎬ采用
３４１３
㊀
动㊀物㊀营㊀养㊀学㊀报３０卷
ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔＲＴＭａｓｔｅｒＭｉｘ试剂盒的方法进行ꎬ反
转录体系为１０μＬꎮ基因表达量采用ＳＹＢＲＰｒｅｍｉｘＥｘＴａｑＴＭⅡ试剂盒的方法进行测定ꎬ反应体系为２０μＬꎮ以磷酸甘油醛脱氢酶(ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅ￣ｈｙｄｅ￣３￣ｐｈｏｓｐｈａｔｅｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅꎬＧＡＰＤＨ)为管家
基因ꎬ对乳蛋白合成相关基因[α－酪蛋白(αｓ１￣ｃａ￣ｓｅｉｎꎬＣＳＮ１Ｓ１)㊁β－酪蛋白(β￣ｃａｓｅｉｎꎬＣＳＮ２)㊁κ－酪蛋白(κ￣ｃａｓｅｉｎꎬＣＳＮ３)㊁酪氨酸激酶２(Ｊａｎｕｓｋｉｎａｓｅ２ꎬＪＡＫ２)㊁信号转导和转录激活因子５(ｓｉｇｎａｌｔｒａｎｓｄｕｃｅｒａｎｄａｃｔｉｖａｔｏｒｏｆｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ５ꎬＳＴＡＴ５)㊁ｍＴＯＲ㊁Ｓ６Ｋ１㊁４ＥＢＰ１㊁ｅＩＦ４Ｅ和ＡＭＰＫα１]的表达量进行测定ꎬ其引物序列见表１ꎮ实时荧光定量ＰＣＲ的反应程序为:９５.０ħ预变性３０ｓꎻ９５.０ħ变性５ｓꎬ６０ħ退火３４ｓꎬ７２ħ延伸２０ｓꎬ进行４０个循环反应ꎻ９５ħ㊁５ｓꎬ６０ħ㊁３０ｓꎬ９５ħ㊁１５ｓꎬ５１个循环ꎬ绘制熔解曲线ꎮ基因的表达量采用２－әәＣｔ法计算ꎮ
表１　乳蛋白合成相关基因的引物
Ｔａｂｌｅ１㊀Ｐｒｉｍｅｒｓｏｆｇｅｎｅｓｉｎｖｏｌｖｅｄｉｎｍｉｌｋｐｒｏｔｅｉｎｓｙｎｔｈｅｓｉｓ
基因Ｇｅｎｅｓ
ＧｅｎＢａｎｋ登录号
ＧｅｎＢａｎｋａｃｃｅｓｓｉｏｎＮｏ.
引物序列
Ｐｒｉｍｅｒｓｅｑｕｅｎｃｅｓ(５' ３')
长度
Ｌｅｎｇｔｈ/ｂｐ
来源
Ｓｏｕｒｃｅ
磷酸甘油醛脱氢酶
ＧＡＰＤＨＸＭ＿００１２５２４７９Ｆ:ＧＧＧＴＣＡＴＣＡＴＣＴＣＴＧＣＡＣＣＴ
Ｒ:ＧＧＴＣＡＴＡＡＧＴＣＣＣＴＣＣＡＣＧＡ１７７Ｓｈｅｎｇ等[５]
α－酪蛋白
ＣＳＮ１Ｓ１ＮＭ＿１８１０２９Ｆ:ＡＣＡＴＣＣＴＡＴＣＡＡＧＣＡＣＣＡＡＧＧＡＣＴＣ
Ｒ:ＧＡＣＧＡＡＡＴＧＣＴＴＴＣＡＧＣＴＴＣＣＡ１９２自行设计
β－酪蛋白
ＣＳＮ２Ｍ－６４７５５.１Ｆ:ＴＣＴＧＣＣＴＣＴＧＣＴＣＣＡＧＴＣＴＴ
Ｒ:ＡＧＧＡＧＧＧＧＧＣＡＴＴＣＡＣＴＴＴ１１６自行设计
κ－酪蛋白
ＣＳＮ３ＮＭ＿１７４２９４Ｆ:ＣＣＡＧＧＡＧＣＡＡＡＡＣＣＡＡＧＡＡＣ
Ｒ:ＴＧＣＡＡＣＴＧＧＴＴＴＣＴＧＴＴＧＧＴ１４８Ｓｈｅｎｇ等[５]
哺乳动物雷帕霉素靶蛋白
ｍＴＯＲＸＭ＿００１７８８２２８Ｆ:ＴＧＡＡＣＴＧＧＡＧＧＣＴＧＡＴＧＧＡＣＡＣ
Ｒ:ＴＧＡＣＴＧＧＣＣＡＧＣＡＧＡＧＴＡＧＧＡＡ８３Ｓｈｅｎｇ等[５]
真核起始因子４Ｅ结合蛋白１
４ＥＢＰ１ＢＣ１２０２９０Ｆ:ＧＧＣＡＧＧＣＧＧＴＧＡＡＧＡＧＴＣ
Ｒ:ＣＣＴＧＧＧＣＴＧＣＧＧＧＡＴ３０２Ｓｈｅｎｇ等[５]
ｐ７０核糖体蛋白Ｓ６激酶１
Ｓ６Ｋ１ＤＮ５４４７７１Ｆ:ＣＡＡＧＣＴＴＧＣＡＴＧＣＴＡＡＴＴＴＧＴＣＣ
Ｒ:ＴＴＧＡＧＴＣＣＴＧＡＴＣＡＴＧＴＣＧＡＡＧＡ１０１Ｓｈｅｎｇ等[５]
信号转导和转录激活因子５
ＳＴＡＴ５ＮＭ＿００１０１２６７３Ｆ:ＡＡＧＡＣＣＣＡＧＡＣＣＡＡＧＴＴＣＧＣ
Ｒ:ＡＧＣＡＣＣＧＴＧＧＣＡＧＴＡＧＣＡＴ４２２自行设计
酪氨酸激酶２
ＪＡＫ２ＤＴ８９７４４９Ｆ:ＴＧＡＡＧＡＡＡＡＣＡＧＧＴＡＡＴＣＡＧＡＣＴＧＧＡ
Ｒ:ＡＡＣＡＴＴＴＴＣＴＣＧＣＴＣＡＡＣＡＧＣＡ１０１Ｓｈｅｎｇ等[５]
真核起始因子４Ｅ
ｅＩＦ４ＥＮＭ＿１７４３１０.３Ｆ:ＧＡＡＧＡＣＴＴＴＴＧＧＧＣＴＣＴＧＴＡＣ
Ｒ:ＣＡＧＣＴＣＣＡＣＡＴＡＣＡＴＣＡＴＣＡＣ８２Ｓｈｅｎｇ等[８]
磷酸腺苷活化的蛋白激酶α１
ＡＭＰＫα１ＮＭ＿００１１０９８０２Ｆ:ＡＣＣＡＴＴＣＴＴＧＧＴＴＧＣＴＧＡＡＡＣＴＣ
Ｒ:ＣＡＣＣＴＴＧＧＴＧＴＴＴＧＧＡＴＴＴＣＴＧ８０自行设计
㊀㊀ＢＭＥＣｓ内乳蛋白合成相关的蛋白磷酸化水平采用蛋白质免疫印迹法测定ꎮ将细胞以５ˑ１０６个/瓶的密度接种于２５ｃｍ２细胞培养瓶中ꎬ按试验设计培养结束后ꎬ弃掉上清ꎬ用磷酸盐缓冲液(ＰＢＳ)清洗细胞２遍ꎬ每瓶加入２５０μＬ含０.１％苯甲基磺酰氟化物(ＰＭＳＦ)的放射免疫沉淀测定(ＲＩＰＡ)细胞裂解液ꎬ４ħ裂解５ｍｉｎ后刮下细胞ꎬ
收集细胞悬液ꎬ４ħ㊁１５４５５ˑｇ离心１０ｍｉｎꎬ取上清用于检测蛋白磷酸化水平ꎮ取适量样品用ＢＣＡ法测定总蛋白质浓度ꎬ随后分别向６０μｇ的每种样品中添加５ˑ蛋白上样缓冲液ꎬ按照４ʒ１的质量体积比混合ꎬ１００ħ加热５ｍｉｎ使蛋白质热变性ꎬ然后按照蛋白质免疫印迹法的步骤进行电泳㊁转膜ꎻ将转膜后的醋酸纤维素(ＰＶＤＦ)膜分别与用一抗稀释液稀释５００倍的一抗结合ꎬ于４ħ孵育过夜ꎬ随后使其分别与用二抗稀释液稀释１０００倍的山羊抗兔二抗结合ꎬ室温摇床孵育１ｈꎻ最后用ＥＣＬ化学超敏显色液进行显色ꎬ在蛋白成像系统上照
４４１３
８期陈㊀璐等:赖氨酸对奶牛乳腺上皮细胞内乳蛋白合成相关基因表达和蛋白磷酸化的影响
相分析ꎮ图片用Ｑｕａｎｔｉｔｙｏｎｅ软件进行灰度值分析ꎬ各蛋白磷酸化水平数据采用各试验组与对照组相比的方法表示ꎮ
１.４㊀数据统计分析
㊀㊀数据采用ＳＡＳ９.０软件的方差分析程序(ＡＮＯＶＡ)进行显著性检验ꎬ同时用回归统计程序进行一次线性与二次曲线回归分析ꎬＰ<０.０５表示组间的差异或回归关系显著ꎬ０.０５ɤＰ<０.１０表示组间的差异或回归关系趋于显著ꎬＰȡ０.１０表示组间的差异或回归关系不显著ꎮ
２㊀结㊀果
２.１㊀Ｌｙｓ对ＢＭＥＣｓ内ＡＴＰ含量及乳蛋白合成相关基因表达的影响
㊀㊀由表２可知ꎬＢＭＥＣｓ内ＲＧＲ呈显著的一次线性下降(Ｐ<０.００１)ꎬ并且４.０~１６.０ｍｍｏｌ/Ｌ组的ＲＧＲ显著低于对照组和１.０~２.０ｍｍｏｌ/Ｌ组(Ｐ<０.０５)ꎻＡＴＰ含量以２.０~１６.０ｍｍｏｌ/Ｌ组显著高于对照组(Ｐ<０.０５)ꎬ２.０ｍｍｏｌ/Ｌ组最高ꎬ回归分析结果显示ꎬ随着Ｌｙｓ浓度的增加ꎬＡＴＰ含量呈趋于显著的二次曲线升高(Ｐ＝０.０５０)ꎮ随着Ｌｙｓ浓度的增加ꎬＣＳＮ１Ｓ１基因表达量呈趋于显著的一次线性降低(Ｐ＝０.０８１)ꎻ以１.０~２.０ｍｍｏｌ/Ｌ组显著高于其他组(Ｐ<０.０５)ꎬ尤以２.０ｍｍｏｌ/Ｌ组最高ꎬ但
４.０~１６.０ｍｍｏｌ/Ｌ组显著低于对照组和１.０~
２.０ｍｍｏｌ/Ｌ组(Ｐ<０.０５)ꎮ１.０~２.０ｍｍｏｌ/Ｌ组的ＣＳＮ２和ＳＴＡＴ５基因表达量显著高于其他组(Ｐ<０.０５)ꎬ以２.０ｍｍｏｌ/Ｌ组最高ꎬ但ＣＳＮ２以
８.０ｍｍｏｌ/Ｌ组最低ꎬＳＴＡＴ５以４.０~１６.０ｍｍｏｌ/Ｌ组显著低于对照组(Ｐ<０.０５)ꎻ１.０~１６.０ｍｍｏｌ/Ｌ组的ＪＡＫ２基因表达量显著高于对照组(Ｐ<
０.０５)ꎮＣＳＮ３(Ｐ＝０.０９３)㊁ｍＴＯＲ(Ｐ＝０.００５)㊁ｅＩＦ４Ｅ(Ｐ＝０.０７６)和ＡＭＰＫα１基因表达量(Ｐ＝０.０４５)随着Ｌｙｓ浓度的增加呈显著或趋于显著的二次曲线变化ꎬ均为先升高后降低ꎮＣＳＮ３基因表达量以１.０~４.０ｍｍｏｌ/Ｌ组显著高于其他组ꎬ但
８.０~１６.０ｍｍｏｌ/Ｌ组显著低于对照组(Ｐ<０.０５)ꎬｍＴＯＲ基因表达量以对照组和１.０~８.０ｍｍｏｌ/Ｌ组显著高于１６.０ｍｍｏｌ/Ｌ组(Ｐ<０.０５)ꎬｅＩＦ４Ｅ基因表达量以２.０~８.０ｍｍｏｌ/Ｌ组显著高于其他各组(Ｐ<０.０５)ꎬＡＭＰＫα１基因表达量以１.０~８.０ｍｍｏｌ/Ｌ组显著高于其他组(Ｐ<０.０５)ꎮ
２.０ｍｍｏｌ/Ｌ组的Ｓ６Ｋ１基因表达量最高ꎬ显著高于对照组(Ｐ<０.０５)ꎬ以１６.０ｍｍｏｌ/Ｌ组最低ꎮ对于
４ＥＢＰ１的基因表达量ꎬ１.０~１６.０ｍｍｏｌ/Ｌ组较对照组显著降低(Ｐ<０.０５)ꎮ
表２㊀Ｌｙｓ对ＢＭＥＣｓ内ＡＴＰ含量和乳蛋白合成相关基因表达量的影响
Ｔａｂｌｅ２㊀ＥｆｆｅｃｔｓｏｆＬｙｓｏｎＡＴＰｃｏｎｔｅｎｔａｎｄｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｌｅｖｅｌｓｏｆｇｅｎｅｓｉｎｖｏｌｖｅｄｉｎｍｉｌｋｐｒｏｔｅｉｎｓｙｎｔｈｅｓｉｓｉｎＢＭＥＣｓ
项目Ｉｔｅｍｓ
Ｌｙｓ浓度
Ｌｙｓｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ/(ｍｍｏｌ/Ｌ)
０.５１.０２.０４.０８.０１６.０
ＳＥＭ
方差分析
Ｐ值
Ｐ￣ｖａｌｕｅ
ｆｏｒＡＮＯＶＡ
Ｐ值Ｐ￣ｖａｌｕｅ
一次
Ｌｉｎｅａｒ
二次
Ｑｕａｄｒａｔｉｃ
相对增殖率ＲＧＲ/％１００.０ａ１０３.９ａ１０２.３ａ９５.３ｂ８３.７ｃ６９.３ｄ１.２７０<０.００１<０.００１０.００４三磷酸腺
ＡＴＰ/(ｎｇ/ｍｇｐｒｏｔ)２６.４９ｂ３２.７０ａｂ４３.１２ａ３７.４５ａ４２.３５ａ３８.０９ａ３.２２４０.０３６０.１８２０.０５０α－酪蛋白
ＣＳＮ１Ｓ１１.００ｃ１.５２ｂ１.６６ａ０.７１ｄ０.４５ｅ０.３８ｅ０.０４２<０.００１０.０８１０.１８１β－酪蛋白
ＣＳＮ２１.００ｃ１.８９ｂ２.０８ａ１.０４ｃ０.９９ｃ１.０６ｃ０.０５６<０.００１０.３６９０.６４５κ－酪蛋白
ＣＳＮ３１.００ｂ１.１４ａ１.１３ａ１.１２ａ０.８４ｃ０.６２ｄ０.０３３<０.００１０.１７８０.０９３
信号转导和转录激活因子５
ＳＴＡＴ５１.００ｃ１.４６ｂ１.７７ａ０.６７ｄ０.４２ｅ０.３９ｅ０.０５１<０.００１０.１０３０.２３０
酪氨酸激酶２
ＪＡＫ２１.００ｄ１.６５ｃ１.９４ｂｃ２.３７ａ２.２６ａｂ１.８６ｃ０.１２９<０.００１０.４８９０.１４１
真核起始因子４Ｅ
ｅＩＦ４Ｅ１.００ｃ１.０１ｃ１.２９ｂ１.２２ｂ２.３６ａ０.４４ｄ０.０６５<０.００１０.６５２０.０７６
５４１３
㊀
动㊀物㊀营㊀养㊀学㊀报３０卷续表２
项目Ｉｔｅｍｓ
Ｌｙｓ浓度
Ｌｙｓｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ/(ｍｍｏｌ/Ｌ)
０.５１.０２.０４.０８.０１６.０
ＳＥＭ
方差分析
Ｐ值
Ｐ￣ｖａｌｕｅ
ｆｏｒＡＮＯＶＡ
Ｐ值Ｐ￣ｖａｌｕｅ
一次
Ｌｉｎｅａｒ
二次
Ｑｕａｄｒａｔｉｃ
真核起始因子４Ｅ结合蛋白１
４ＥＢＰ１１.００ａ０.５８ｃ０.７５ｂ０.５８ｃ０.８５ｂ０.７１ｂｃ０.０４２<０.００１０.９８８０.９９８
哺乳动物雷帕霉素靶蛋白
ｍＴＯＲ１.００ａ１.０６ａ１.０４ａ１.００ａ０.９８ａ０.７１ｂ０.０６５０.００７０.００６０.００５ｐ７０核糖体蛋白Ｓ６激酶１
Ｓ６Ｋ１１.００ｂ１.０９ａｂ１.２８ａ１.１０ａｂ１.０７ｂ０.９３ｂ０.０６００.００５０.２４２０.４２７磷酸腺苷活化的蛋白
激酶α１
ＡＭＰＫα１
１.００ｅ１.２４ｄ１.５４ｃ２.００ａ１.７７ｂ０.８５ｅ０.０７１<０.００１０.６１２０.０４５
㊀㊀ＳＥＭ表示平均值的标准误ꎮ同行数据相同或无字母肩标表示差异不显著(Ｐ>０.０５)ꎬ不同字母肩标表示差异显著(Ｐ<０.０５)ꎮＰ<０.０５表示回归关系显著ꎻ０.０５ɤＰ<０.１０表示回归关系趋于显著ꎻＰȡ０.１０表示回归关系不显著ꎮ下表同ꎮ
㊀㊀ＳＥＭｍｅａｎｓｓｔａｎｄａｒｄｅｒｒｏｒｏｆｔｈｅｍｅａｎ.Ｖａｌｕｅｓｏｆｔｈｅｓａｍｅｒｏｗｗｉｔｈｔｈｅｓａｍｅｏｒｎｏｌｅｔｔｅｒｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔｓｍｅａｎｎｏｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ(Ｐ>０.０５)ꎬｗｈｉｌｅｗｉｔｈｄｉｆｆｅｒｅｎｔｌｅｔｔｅｒｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔｓｍｅａｎｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ(Ｐ<０.０５).Ｐ<０.０５ｍｅａｎｓｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｒｅ￣ｇｒｅｓｓｉｏｎ.０.０５ɤＰ<０.１０ｍｅａｎｓｔｈａｔｔｈｅｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎｔｅｎｄｓｔｏｂｅｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ.Ｐȡ０.１０ｍｅａｎｓｎｏｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ.Ｔｈｅｓａｍｅａｓｂｅｌｏｗ.
２.２㊀Ｌｙｓ对乳蛋白合成相关蛋白磷酸化的影响㊀㊀由表３和图１可知ꎬ随着Ｌｙｓ浓度的增加ꎬｍＴＯＲ(Ｐ＝０.０３８)和Ｓ６Ｋ１磷酸化水平(Ｐ＝０.０２２)呈显著的一次线性降低ꎮｅＩＦ４Ｅ的磷酸化水平以２.０~４.０ｍｍｏｌ/Ｌ组较高ꎬ显著高于其他各组(Ｐ<０.０５)ꎬ但１６.０ｍｍｏｌ/Ｌ组与对照组相比差异不显著(Ｐ>０.０５)ꎮ磷酸腺苷活化的蛋白激酶
(ＡＭＰＫ)的磷酸化水平随着Ｌｙｓ浓度的增加呈显著的一次线性升高(Ｐ＝０.０１４)ꎮ
表３㊀Ｌｙｓ对ＢＭＥＣｓ内乳蛋白合成相关蛋白磷酸化水平的影响
Ｔａｂｌｅ３㊀ＥｆｆｅｃｔｓｏｆＬｙｓｏｎｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎｌｅｖｅｌｓｏｆｐｒｏｔｅｉｎｓｉｎｖｏｌｖｅｄｉｎｍｉｌｋｐｒｏｔｅｉｎｓｙｎｔｈｅｓｉｓｉｎＢＭＥＣｓ
项目Ｉｔｅｍｓ
Ｌｙｓ浓度
Ｌｙｓｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ/(ｍｍｏｌ/Ｌ)
０.５１.０２.０４.０８.０１６.０
ＳＥＭ
方差分析
Ｐ值
Ｐ￣ｖａｌｕｅ
ｆｏｒＡＮＯＶＡ
Ｐ值Ｐ￣ｖａｌｕｅ
一次
Ｌｉｎｅａｒ
二次
Ｑｕａｄｒａｔｉｃ
哺乳动物雷帕霉素靶蛋白
ｍＴＯＲ(Ｓｅｒ２４４８)１.００１.２７１.２３１.０８１.０７０.７７０.１４１０.１９７０.０３８０.１５９真核起始因子４Ｅ结合蛋白１
４ＥＢＰ１(Ｔｈｒ３７)１.００１.０２０.９９０.８７０.９５０.９１０.１０６０.８４１０.４２９０.６８３真核起始因子４Ｅ
ｅＩＦ４Ｅ(Ｓｅｒ２０９)１.００ｃ１.１８ｂ１.３０ａ１.２６ａ１.１５ｂ１.０６ｃ０.０２２<０.００１０.５６８０.５４４ｐ７０核糖体蛋白Ｓ６激酶１
Ｓ６Ｋ１(Ｔｈｒ３８９)１.００１.０３１.１０１.０５０.９８０.８３０.０９５０.１２５０.０２２０.０４９磷酸腺苷活化的蛋白激酶
ＡＭＰＫ(Ｔｈｒ１７２)１.０００.７６０.７５１.１５１.２０１.５５０.３３８０.６２６０.０１４０.０７８㊀㊀括号内为磷酸化位点ꎮＰｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎｓｉｔｓｗｅｒｅｓｈｏｗｅｄｉｎｐａｒｅｎｔｈｅｓｅｓ.
３㊀讨㊀论
㊀㊀酪蛋白在牛乳蛋白中大约占８０％ꎬ它主要包括ＣＳＮ１Ｓ１㊁αｓ２－酪蛋白(αｓ２￣ｃａｓｅｉｎꎬＣＳＮ１Ｓ２)㊁ＣＳＮ２和ＣＳＮ３ꎬ尤以ＣＳＮ１Ｓ１和ＣＳＮ２的含量较
高ꎬ分别为４０％和２５％左右[９]ꎮＣＳＮ１Ｓ１㊁ＣＳＮ２和ＣＳＮ３是反映乳蛋白合成的３个主要基因ꎬ其表达
量会影响ＢＭＥＣｓ内乳蛋白的合成ꎮＮａｎ等[１０]研
６４１３
８期陈㊀璐等:赖氨酸对奶牛乳腺上皮细胞内乳蛋白合成相关基因表达和蛋白磷酸化的影响究发现ꎬ与０ｍｍｏｌ/Ｌ的Ｌｙｓ组相比ꎬ１.２ｍｍｏｌ/Ｌ的Ｌｙｓ组显著的上调了ＢＭＥＣｓ内ＣＳＮ１Ｓ１㊁ＣＳＮ２和ＣＳＮ３基因的表达ꎮ本研究结果得出ꎬＬｙｓ显著促进了ＣＳＮ１Ｓ１㊁ＣＳＮ２和ＣＳＮ３基因表达ꎬ均以
１.０~２.０ｍｍｏｌ/Ｌ组促进效果较好ꎬ且Ｌｙｓ对ＣＳＮ３和ＣＳＮ１Ｓ１基因表达的促进效果呈剂量依赖关系ꎬ高剂量的１６.０ｍｍｏｌ/Ｌ组显著抑制其表达
ꎮ
㊀㊀括号内为磷酸化位点ꎮＰｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎｓｉｔｓｗｅｒｅｓｈｏｗｅｄｉｎｐａｒｅｎｔｈｅｓｅｓ.
图１㊀Ｌｙｓ对ＢＭＥＣｓ内ｍＴＯＲ信号通路磷酸化水平的影响
Ｆｉｇ.１㊀ＥｆｆｅｃｔｓｏｆＬｙｓｏｎｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎｏｆｍＴＯＲｓｉｇｎａｌｉｎｇｐａｔｈｗａｙｉｎＢＭＥＣｓ
㊀㊀酪氨酸激酶(ＪＡＫ)/信号转导和转录激活因子(ＳＴＡＴ)和ｍＴＯＲ信号通路是调控蛋白质合成的２条重要通路[１１－１２]ꎮＪＡＫ/ＳＴＡＴ信号通路中ꎬ对乳蛋白合成调控的研究主要集中在ＪＡＫ２/ＳＴＡＴ５信号通路上ꎮＬｉｕ等[１３]研究指出ꎬ添加Ｌｙｓ可显著提高ＢＭＥＣｓ内ＳＴＡＴ５基因表达量ꎬ然而ＳＴＡＴ５沉默后ＣＳＮ２基因表达量下降ꎬ过表达后上调其表达ꎬ说明Ｌｙｓ可能通过ＪＡＫ２/ＳＴＡＴ５信号通路影响乳蛋白的合成ꎮ本研究发现ꎬＬｙｓ可显著促进ＳＴＡＴ５和ＪＡＫ２基因表达ꎬＳＴＡＴ５以２.０ｍｍｏｌ/Ｌ组促进效果最好ꎬ但高剂量４.０~１６.０ｍｍｏｌ/Ｌ组显著抑制其表达ꎬ与Ｌｙｓ对酪蛋白基因表达的作用效果相似ꎬ进一步验证了Ｌｙｓ可能通过ＪＡＫ２/ＳＴＡＴ５信号通路促进乳蛋白的合成ꎮ
㊀㊀ｍＴＯＲ信号通路在蛋白质翻译水平上调控乳蛋白合成[１２]ꎮ４ＥＢＰ１和Ｓ６Ｋ１是ｍＴＯＲ信号通路
下游的２个关键元件ꎬ当ｍＴＯＲ被上游信号激活后会通过调节Ｓ６Ｋ１和４ＥＢＰ１这２条下游通路来调控动物机体内蛋白质的翻译ꎻ然而４ＥＢＰ１和ｅｌＦ４Ｅ的结合会抑制蛋白质翻译ꎬ当ｍＴＯＲ激活４ＥＢＰ１磷酸化后ꎬ磷酸化的４ＥＢＰ１与ｅｌＦ４Ｅ脱离ꎬ降低了对蛋白质翻译的抑制ꎬ促进蛋白质的合成ꎮ本研究发现ꎬ适宜浓度的Ｌｙｓ促进了ｍＴＯＲ㊁Ｓ６Ｋ１基因表达和ｅＩＦ４Ｅ基因表达及磷酸化ꎬ但８.０~１６.０ｍｍｏｌ/Ｌ组其促进作用减弱或具有抑制作用ꎮＬｙｓ浓度的增加抑制了４ＥＢＰ１的基因表达ꎬ而对其磷酸化水平无显著影响ꎮ毕微微[１４]研究发现ꎬ添加Ｌｙｓ上调了ＢＭＥＣｓ内ｍＴＯＲ信号通路中与乳蛋白翻译相关的ｍＴＯＲ和Ｓ６Ｋ１基因表达ꎬ但下调了４ＥＢＰ１基因的表达ꎬ与本研究的结果相似ꎮ这些研究结果提示Ｌｙｓ可能通过促进ｍＴＯＲ信号通路相关基因表达和磷酸化剂量依赖性地影响乳蛋白合成基因的表达ꎮ
㊀㊀氨基酸和ＡＴＰ是蛋白质合成过程中非常重要的２个因素ꎬ二者的供给直接影响乳品质的高低ꎮ乳腺合成和分泌乳蛋白时需要大量的能量ꎬ大约会消耗掉ＢＭＥＣｓ内约５０％的ＡＴＰ[１５]ꎮＡＭＰＫ是细胞内主要的能量感受器ꎬ参与多种代谢信号通路ꎬ调节机体代谢和能量的供需平衡[１６]ꎮＡＭＰＫ
还是ｍＴＯＲ信号通路的上游调控元件ꎬ负调控ｍＴＯＲ介导的下游信号通路[１７]ꎮ当细胞内ＡＴＰ/７
４１３
㊀
动㊀物㊀营㊀养㊀学㊀报３０卷
一磷酸腺苷(ＡＭＰ)降低或营养物质缺乏会激活ＡＭＰＫꎬ从而增加ＡＴＰ的分解和减少ＡＴＰ的合
成[１８－１９]ꎮ因此ꎬＡＭＰＫ可以通过ｍＴＯＲ信号通路从蛋白质翻译水平来调控乳蛋白的合成ꎮ王珊
珊[２０]研究表明ꎬ随着氨基酸浓度的下降细胞内营养物质和能量水平也下降了ꎬ进而激活ＡＭＰＫꎬ抑制ｍＴＯＲ㊁Ｓ６Ｋ１和４ＥＢＰ１的磷酸化ꎬ减少乳蛋白的合成ꎮ本研究发现ꎬ添加一定浓度的Ｌｙｓ在提高ｍＴＯＲ基因表达量及ＡＴＰ含量的同时ꎬ也促进了ＡＭＰＫα１基因表达ꎬ但高剂量的１６.０ｍｍｏｌ/Ｌ组反而显著降低了ｍＴＯＲ和ＡＭＰＫα１基因的表达量ꎬ与前人的研究结果不尽一致ꎬ造成这些结果差异的原因尚不清楚ꎬ需要进一步探讨ꎮ
㊀㊀本研究结果也得出ꎬＬｙｓ浓度与ＡＴＰ含量ꎬＣＳＮ１Ｓ１㊁ＣＳＮ３㊁ｍＴＯＲ㊁ｅＩＦ４Ｅ和ＡＭＰＫα１的基因表达量以及ｍＴＯＲ㊁Ｓ６Ｋ１和ＡＭＰＫ的磷酸化水平存在显著或趋于显著的剂量依赖关系ꎬＡＴＰ含量以２.０~１６.０ｍｍｏｌ/Ｌ组ꎬＣＳＮ１Ｓ１㊁ＣＳＮ２㊁ＳＴＡＴ５基因表达量以１.０~２.０ｍｍｏｌ/Ｌ组ꎬｍＴＯＲ基因表达量以１.０~８.０ｍｍｏｌ/Ｌ组ꎬＣＳＮ３基因表达量以１.０~４.０ｍｍｏｌ/Ｌ组ꎬＪＡＫ２基因表达量以１.０~１６.０ｍｍｏｌ/Ｌ组ꎬＳ６Ｋ１基因表达量以２.０ｍｍｏｌ/Ｌ组ꎬｅＩＦ４Ｅ基因表达量以２.０~８.０ｍｍｏｌ/Ｌ组ꎬｅＩＦ４Ｅ磷酸化水平以２.０~４.０ｍｍｏｌ/Ｌ组时促进效果较好ꎻ但１６.０ｍｍｏｌ/Ｌ组的调节作用减弱或呈相反的变化趋势ꎮ李喜艳[７]研究发现ꎬ虽然提高了ＢＭＥＣｓ培养基中个别氨基酸的添加量ꎬ但是会导致氨基酸配比不平衡进而严重影响乳蛋白的合成ꎬ因此ꎬ高剂量Ｌｙｓ会抑制乳蛋白合成相关基因表达可能与氨基酸配比不平衡有关ꎮ此外ꎬＭｅｒｃｉ￣ｅｒ等[２１]的研究指出ꎬＢＭＥＣｓ的数量在某种程度上可能决定了乳蛋白的合成量ꎬ同时ꎬ高海娜等[２２]研究也发现ꎬ添加０.５~２.０ｍｍｏｌ/ＬＬｙｓ促进ＢＭＥＣｓ增殖ꎬ但高剂量会抑制其增殖ꎬ与本研究适宜浓度Ｌｙｓ促进细胞增殖ꎬ而高剂量抑制其增殖的结果相似ꎬ进一步解释了高剂量Ｌｙｓ会抑制乳蛋白合成相关基因表达ꎮ因此ꎬＬｙｓ浓度为１.０~２.０ｍｍｏｌ/Ｌ时ꎬ对ＢＭＥＣｓ内乳蛋白合成相关基因表达的促进效果较好ꎮ
㊀㊀Ｂｒａｚｉｌ等[２３]指出ꎬ磷脂酰肌醇－３－激酶(ＰＩ３Ｋ)/蛋白激酶Ｂ(Ａｋｔ)/ｍＴＯＲ信号通路是调控ｍＴＯＲ信号通路非常重要的上游调控通路ꎬ对ｍＴＯＲ信号通路起正调控作用ꎮ还有研究指出ꎬＡｋｔ可能通过结节性硬化症复合物１(ＴＳＣ１)/结
节性硬化症复合物２(ＴＳＣ２)间接地调控ｍＴＯＲ信
号通路[２４]ꎮ这些结果说明ꎬＬｙｓ可能是通过ＰＩ３Ｋ/Ａｋｔ/ｍＴＯＲ信号通路调控ｍＴＯＲ通路进而促进乳
蛋白合成相关基因的表达ꎬ但本试验并未对ＰＩ３Ｋ/Ａｋｔ/ｍＴＯＲ信号通路进行研究ꎬ具体调控机理尚不清楚ꎬ需要进一步研究ꎮ
４㊀结㊀论
㊀㊀Ｌｙｓ对ＢＭＥＣｓ内乳蛋白合成相关基因表达的
促进效果呈剂量依赖关系ꎬ以浓度为１.０~２.０ｍｍｏｌ/Ｌ时较好ꎬ高浓度(１６.０ｍｍｏｌ/Ｌ)Ｌｙｓ抑制乳蛋白合成相关基因的表达ꎬＬｙｓ可能通过ＪＡＫ２/ＳＴＡＴ５和ｍＴＯＲ信号通路促进乳蛋白合成相关基因的表达ꎮ
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ｇｅｎｅｓｒｅｌａｔｅｄｔｏｆａｔａｎｄｐｒｏｔｅｉｎｉｎｔｈｅｂｏｖｉｎｅｍａｍｍａ￣
８４１３
８期陈㊀璐等:赖氨酸对奶牛乳腺上皮细胞内乳蛋白合成相关基因表达和蛋白磷酸化的影响
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ａｃｉｄｓｏｎｍａｍｍａｌｉａｎｔａｒｇｅｔｏｆｒａｐａｍｙｃｉｎ(ｍＴＯＲ)
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９４１３
㊀
动㊀物㊀营㊀养㊀学㊀报３０卷
∗ＣｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇａｕｔｈｏｒꎬｐｒｏｆｅｓｓｏｒꎬＥ￣ｍａｉｌ:ｙａｎｓｍｉｍａｕ＠１６３.ｃｏｍ
(责任编辑㊀王智航)
ＥｆｆｅｃｔｓｏｆＬｙｓｉｎｅｏｎＧｅｎｅＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓａｎｄＰｒｏｔｅｉｎＰｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎＩｎｖｏｌｖｅｄｉｎＭｉｌｋＰｒｏｔｅｉｎＳｙｎｔｈｅｓｉｓｉｎＢｏｖｉｎｅＭａｍｍａｒｙＥｐｉｔｈｅｌｉａｌＣｅｌｌｓ
ＣＨＥＮＬｕ㊀ＺＨＡＯＹａｎｌｉ㊀ＧＵＯＸｉａｏｙｕ㊀ＳＨＩＢｉｎｌｉｎ㊀ＹＡＮＳｕｍｅｉ∗
(ＣｏｌｌａｇｅｏｆＡｎｉｍａｌＳｃｉｅｎｃｅꎬＩｎｎｅｒＭｏｎｇｏｌｉａＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬＨｏｈｈｏｔ０１００１８ꎬＣｈｉｎａ)
Ａｂｓｔｒａｃｔ:Ｔｈｅｏｂｊｅｃｔｉｖｅｏｆｔｈｉｓｓｔｕｄｙｗａｓｔｏｄｅｔｅｒｍｉｎｅｔｈｅｅｆｆｅｃｔｓｏｆｌｙｓｉｎｅ(Ｌｙｓ)ｏｎｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓａｎｄｐｒｏｔｅｉｎｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎｉｎｖｏｌｖｅｄｉｎｍｉｌｋｐｒｏｔｅｉｎｓｙｎｔｈｅｓｉｓｉｎｂｏｖｉｎｅｍａｍｍａｒｙｅｐｉｔｈｅｌｉａｌｃｅｌｌｓ(ＢＭＥＣｓ).Ｔｈｅ３ｒｄｇｅｎｅｒａｔｉｏｎＢＭＥＣｓｗｅｒｅｒａｎｄｏｍｌｙｄｉｖｉｄｅｄｉｎｔｏｓｉｘｇｒｏｕｐｗｉｔｈｓｉｘｒｅｐｌｉｃａｔｅｓｐｅｒｇｒｏｕｐꎬｃｅｌｌｓｉｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔｇｒｏｕｐｓｗｅｒｅｃｕｌｔｕｒｅｄｉｎｍｅｄｉｕｍｗｉｔｈ０.５(ｃｏｎｔｒｏｌ)ꎬ１.０ꎬ２.０ꎬ４.０ꎬ８.０ａｎｄ１６.０ｍｍｏｌ/ＬＬｙｓꎬｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ.Ａｆｔｅｒ４８ｈｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎａｔ３７ħａｎｄ５％ＣＯ２ꎬａｄｅｎｏｓｉｎｅｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ(ＡＴＰ)ｃｏｎｔｅｎｔｗａｓｍｅａｓｕｒｅｄｂｙｔｈｅ
ｍｅｔｈｏｄｏｆｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅꎬｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｌｅｖｅｌｓｏｆｇｅｎｅｓｉｎｖｏｌｖｅｄｉｎｍｉｌｋｐｒｏｔｅｉｎｓｙｎｔｈｅｓｉｓｗｅｒｅｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄｂｙｒｅａｌ￣ｔｉｍｅＰＣＲꎬａｎｄｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎｌｅｖｅｌｓｏｆｐｒｏｔｅｉｎｓｉｎｖｏｌｖｅｄｉｎｍｉｌｋｐｒｏｔｅｉｎｓｙｎｔｈｅｓｉｓｗｅｒｅｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄｂｙＷｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｔｉｎｇｍｅｔｈｏｄ.Ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄａｓｆｏｌｌｏｗｓ:ｗｉｔｈｔｈｅｉｎｃｒｅａｓｅｏｆＬｙｓｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎꎬＡＴＰｃｏｎｔｅｎｔｔｅｎｄｅｄｔｏｂｅｑｕａｄｒａｔｉｃａｌｌｙｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｉｎｃｒｅａｓｅｄ(Ｐ＝０.０５０)ꎻｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｌｅｖｅｌｓｏｆκ￣ｃａｓｅｉｎ(ＣＳＮ３)(Ｐ＝０.０９３)ꎬｍａｍｍａｌｉａｎｔａｒｇｅｔｏｆｒａｐａｍｙｃｉｎ(ｍＴＯＲ)(Ｐ＝０.００５)ꎬｅｕｋａｒｙｏｔｉｃｉｎｉｔｉａｔｉｏｎｆａｃｔｏｒ４Ｅ(ｅＩＦ４Ｅ)(Ｐ＝０.０７６)ａｎｄａｄｅｎｏｓｉｎｅ５ ￣ｍｏｎｏ￣ｐｈｐｓｐｈａｔｅ￣ａｃｔｉｖｅｐｒｏｔｅｉｎｋｉｎａｓｅα１(ＡＭＰＫα１)ｇｅｎｅｓ(Ｐ＝０.０４５)ｗｅｒｅｓｉｇ￣ｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｏｒｔｅｎｄｅｄｔｏｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｑｕａｄｒａｔｉｃａｌｌｙｃｈａｎｇｅｄꎬａｌｌｓｈｏｗｅｄｆｉｒｓｔｌｙｉｎｃｒｅａｓｅｄｔｈｅｎｄｅｃｒｅａｓｅｄꎻｅｘｐｒｅｓ￣ｓｉｏｎｌｅｖｅｌｏｆαｓ１￣ｃａｓｅｉｎ(ＣＳＮ１Ｓ１)ｇｅｎｅ(Ｐ＝０.０８１)ꎬｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎｌｅｖｅｌｓｏｆｍＴＯＲ(Ｐ＝０.０３８)ａｎｄｒｉｂｏ￣ｓｏｍａｌｐｒｏｔｅｉｎＳ６ｋｉｎａｓｅ１(Ｓ６Ｋ１)(Ｐ＝０.０２２)ｗｅｒｅｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｏｒｔｅｎｄｔｏｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｌｉｎｅａｒｌｙｄｅｃｒｅａｓｅｄꎻ
ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎｌｅｖｅｌｏｆａｄｅｎｏｓｉｎｅ５ ￣ｍｏｎｏ￣ｐｈｐｓｐｈａｔｅ￣ａｃｔｉｖｅｐｒｏｔｅｉｎｋｉｎａｓｅ(ＡＭＰＫ)ｗａｓｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｌｉｎｅａｒ￣ｌｙｉｎｃｒｅａｓｅｄ(Ｐ＝０.０１４).ＴｈｅｒｅｓｕｌｔｓｏｆａｎａｌｙｓｉｓｏｆｖａｒｉａｎｃｅｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎｏｆＬｙｓｈａｄｓｉｇｎｉｆ￣ｉｃａｎｔｌｙｅｆｆｅｃｔｓｏｎＡＴＰｃｏｎｔｅｎｔꎬｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｌｅｖｅｌｓｏｆｇｅｎｅｓｉｎｖｏｌｖｅｄｉｎｍｉｌｋｐｒｏｔｅｉｎｓｙｎｔｈｅｓｉｓａｎｄｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａ￣ｔｉｏｎｌｅｖｅｌｏｆｅＩＦ４Ｅ(Ｐ<０.０５)ꎬａｍｏｎｇｔｈｅｍꎬｔｈｅｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔｅｆｆｅｃｔｓｏｆ２.０ｔｏ１６.０ｍｍｏｌ/ＬＬｙｓｆｏｒＡＴＰｃｏｎｔｅｎｔꎬ１.０ｔｏ２.０ｍｍｏｌ/ＬＬｙｓｆｏｒＣＳＮ１Ｓ１ꎬβ￣ｃａｓｅｉｎ(ＣＳＮ２)ꎬｓｉｇｎａｌｔｒａｎｓｄｕｃｅｒａｎｄａｃｔｉｖａｔｏｒｏｆｔｒａｎｓｃｒｉｐ￣ｔｉｏｎ５(ＳＴＡＴ５)ｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｌｅｖｅｌｓꎬ１.０ｔｏ８.０ｍｍｏｌ/ＬＬｙｓｆｏｒｍＴＯＲｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｌｅｖｅｌꎬ１.０ｔｏ４.０ｍｍｏｌ/ＬＬｙｓｆｏｒＣＳＮ３ｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｌｅｖｅｌꎬ１.０ｔｏ１６.０ｍｍｏｌ/ＬＬｙｓｆｏｒＪａｎｕｓｋｉｎａｓｅ２(ＪＡＫ２)ｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｌｅｖｅｌꎬ２.０ｍｍｏｌ/ＬＬｙｓｆｏｒＳ６Ｋ１ｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｌｅｖｅｌꎬ２.０ｔｏ８.０ｍｍｏｌ/ＬＬｙｓｆｏｒｅＩＦ４Ｅｇｅｎｅｅｘ￣ｐｒｅｓｓｉｏｎｌｅｖｅｌꎬ２.０ｔｏ４.０ｍｍｏｌ/ＬＬｙｓｆｏｒｅＩＦ４Ｅｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎｌｅｖｅｌｗｅｒｅｂｅｔｔｅｒꎬｈｏｗｅｖｅｒꎬ１６.０ｍｍｏｌ/ＬＬｙｓｈａｄｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎｅｆｆｅｃｔｓｏｎｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｌｅｖｅｌｓｏｆＣＳＮ１Ｓ１ꎬＣＳＮ３ꎬＳＴＡＴ５ａｎｄｍＴＯＲｇｅｎｅｓꎬａｎｄ１.０ｔｏ１６.０ｍｍｏｌ/ＬＬｙｓｈａｄｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎｅｆｆｅｃｔｏｎｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｌｅｖｅｌｏｆｅｕｋａｒｙｏｔｉｃｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ４Ｅｂｉｎｄｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎ１(４ＥＢＰ１)ｇｅｎｅ.ＩｎｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎꎬｔｈｅｏｐｔｉｍａｌＬｙｓｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｆｏｒｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓｉｎｖｏｌｖｅｄｉｎｍｉｌｋｐｒｏｔｅｉｎ
ｓｙｎｔｈｅｓｉｓｉｎＢＭＥＣｓｉｓ１.０ｔｏ２.０ｍｍｏｌ/Ｌ.[ＣｈｉｎｅｓｅＪｏｕｒｎａｌｏｆＡｎｉｍａｌＮｕｔｒｉｔｉｏｎꎬ２０１８ꎬ３０(８):３１４２￣３１５０]Ｋｅｙｗｏｒｄｓ:ｄａｉｒｙｃｏｗꎻｂｏｖｉｎｅｍａｍｍａｒｙｅｐｉｔｈｅｌｉａｌｃｅｌｌꎻｌｙｓｉｎｅꎻｍｉｌｋｐｒｏｔｅｉｎ
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