多糖的提取和纯化

多糖的提取和纯化之杨若古兰创作
多糖的提取和纯化多糖的提取和纯化摘要本文较具体地介绍了多糖的提取和纯化方法，为多糖的研讨和生产提供参考根据.关键词多糖；提取；纯化；活性炭多糖（polysacharides，PS），又称多聚糖，是由10个以上的单糖通过苷键连接而成的，具有广泛生物活性的天然大分子化合物.它广泛分布于天然界高等植物、藻类、微生物（细菌和真菌）与动物体内.20世纪60年代以来，人们逐步发现多糖具有复杂的、多方面的生物活性和功能[1]：(1)多糖可作为广谱免疫促进剂，具有免疫调节功能，能医治风湿病、慢性病毒性肝炎、癌症等免疫零碎疾病，甚至能抗AIDS病毒[2].如甘草多糖具有明显的抗病毒和抗肿瘤感化[10]，黑木耳多糖、银杏外种皮多糖和芦荟多糖可抗肿瘤和加强人体免疫功能[3-5].(2)多糖具有抗感染、抗放射、抗凝血、降血糖、降血脂、促进核酸与蛋白质的生物合成感化.如柴胡多糖具有抗辐射，加强免疫功能等生物学感化[6]，麦冬多糖具有降血糖及免疫加强感化[7-8]，动物黏多糖具有抗凝血、降血脂等功能[9].(3)多糖能控制细胞分裂和分化，调节细胞的生长与衰老.如爬山虎多糖具有抗病毒和抗衰老感化[10]，银杏外种皮粗多糖具有抗衰老、抗过敏、降血脂、止咳祛痰、减肥等功能[11].另外，多糖作为药物，其毒性极小，因此多糖的研讨已惹起人们极大的爱好. 因为多糖
具有的生物活性与其结构紧密相干，而多糖的结构又是相当复杂的，所以在这一领域的研讨绝对缓慢.但人们在多糖的分离提取与纯化方面已做出了很多工作.1. 多糖的提取[12]1.1 热水浸提法：1.1.1多糖提取条件的优选根据文献报导[13]：影响热水浸提多糖的身分次要有提取时间、提取次数、溶剂体积、浸提温度、pH值、醇析浓度和植物颗粒大小等.在试验前对上述多种身分利用正交实验法做出优选，才干选出最好提取方案.1.1.2其步调为：原料→粉碎→脱脂→粗提（2－3次）→吸滤或离心→沉淀→洗濯→干燥首先除去概况脂肪.原料经粉碎后加入甲醇、乙醚、乙醇、丙酮或1：1的乙醇乙醚混合液，水浴加热搅拌或回流1－3小时，脱脂后过滤得到的残渣普通用水作溶剂（也有效氢氧化钾碱性水液、氯化钠水液、1％醋酸和1％苯酚或0.1－1M 氢氧化钠作为提取溶剂）提取多糖.温度控制在90－100℃，搅拌4－6小时，反复提取2－3次.得到的多糖提取液大多较黏稠，可进行吸滤.也可用离心法将不溶性杂质除去，将滤液或上清液混合（得到的多糖若为碱性则须要中和）.然后浓缩，再加入2－5倍低级醇（甲醇或乙醇）沉淀多糖；也可加入费林氏溶液或硫酸铵或溴化十六烷基三甲基铵等，与多糖物资结合生成不溶性络合物或盐类沉淀.然后顺次用乙醇、丙酮和乙醚洗濯.将洗干后疏松的多糖敏捷转入装有五氧化二磷和氢氧化钠的真空干燥器中减压干燥（若
沉淀的多糖为胶状或具粘着性时，可直接冷冻干燥）.干燥后可得粉末状的粗多糖.1.2 微波辅助提取法：其道理为利用分歧极性的介质对微波能的分歧接收程度，使基体物资中的某些区域和萃取体系中的某些组分被选择性加热，从而使萃取物资从基体或体系平分离出来，进入到介电常数小，微波接收能力较差的萃取剂中[14].因为微波能极大加速细胞壁的破裂，因此利用于中草药中无效成分的提取能极大加快提取速度，添加提取产率.而且因为其选择性好，提取后基体能坚持良好的性状，提取液也较普通的提取方法澄清[15].聂金源等在柴胡多糖和黄酮化合物的提取[18]中对微波辅助提取法、超声辅助法和索氏提取法进行比较，发现微波辅助提取法所需时间最短（10min），多糖的提取率最高（28.46％）.1.3 超声辅助法：其道理是利用超声波的空化感化加速植物无效成分的浸出提取，另外超声波的次级效应，如机械振动、乳化、扩散、击碎、化学效应等也能加速欲提取成分的扩散释放并充分与溶剂混合，利于提取[16].超声波辅助法与惯例提取法比拟，具有提取时间短、产率高、无需加热等长处[17].1.4 索氏提取法：将植物粉末置于索氏提取器中，加入石油醚，60℃-90℃条件下提取至无色（普通为6小时）.过滤，滤渣挥发干燥完溶媒后加入80%乙醇，再提取6小时，过滤，滤渣乙醇挥发干燥后加蒸馏水.回流提取2次，趁热过滤，滤液减压浓缩，再除蛋
白，醇沉，除色素.60℃干燥，称重.1.5 醇提法：前后将90%和50%乙醇加入植物粉末中，振荡充分再抽滤.滤液中加入充足无水乙醇，至于4℃冰箱中过夜.减压抽滤，再除去色素，得多糖粗品，在60℃通风干燥箱中干燥，再置干燥皿中恒重保管.醇提法方法简单，易于操纵，但提取率较低，乙醇使用量大，不宜大规模提取使用.1.6 其它方法：多糖的提取方法还有稀碱液浸提法、稀酸液浸提法、酶法等.但因为稀酸、稀碱条件下，易使多糖发生糖苷键的断裂，部分多糖发生水解而使多糖的提取率减少，因此很多试验中防止采取稀碱液浸提法和稀酸液浸提法.2. 多糖的纯化2.1 多糖中杂质除去方法粗多糖中常常混杂着蛋白质、色素、低聚糖等杂质，必须分别除去.2.1.1 除蛋白质采取醇沉或其它溶剂沉淀所获得的多糖，常混有较多的蛋白质，脱去蛋白质的方法有多种：如选择能使蛋白质沉淀而不使多糖沉淀的酚、三氯甲烷、鞣质等试剂来处理，但用酸性试剂宜短，温度宜低，以避免多糖降解.经常使用的方法有[19]：2.1.1.1 沙维积法（Sevag法）[20]：根据蛋白质在氯仿等无机溶剂变性而不溶与水的特点，将多糖水溶液、氯仿、戊醇（或正丁醇）之比调为25:5:1或25:4:1，混合物剧烈振摇20到30分钟，蛋白质与氯仿－戊醇（或正丁醇）生成凝胶物而分离，然后离心，分去水层和溶剂层交界处的变性蛋白质.此种方法较暖和，在防止降解上有较好后果，但效力不高，
如五味子多糖的提取实验中要反复处理达三十几次.而且每次除去蛋白量变性胶状物时，不成防止的溶有少量多糖，另外少量多糖与蛋白质结合的蛋白聚糖和糖蛋白，在处理时会沉淀上去，形成多糖的损失.如能配合加入一些蛋白质水解酶，再用Sevage法后果更佳.2.1.1.2 三氟三氯乙烷法[21]：多糖溶液与三氟三氯乙烷等体积混合，低温下搅拌10min摆布，离心得上面水层，水层继续用上述方法处理几次，即得无蛋白质的多糖溶液，此法效力高，但溶剂沸点较低，易挥发，不宜大量利用.2.1.1.3 三氯醋酸法：在多糖水溶液中滴加5％－30％三氯醋酸，直至溶液不再继续混浊为止，在5－10℃放置过夜，离心除去沉淀即得无蛋白质的多糖溶液.此法会惹起某些多糖的降解.Sevag法、三氟三氯乙烷法和三氯醋酸法三种方法均不适合糖肽，因糖肽也会像蛋白质那样沉淀出来.对于对碱波动的糖蛋白，在硼氢化钾存鄙人，用稀碱暖和处理，可以把这类结合蛋白质分开[1].2.1.1.4 酶解法[22]：在样品溶液中加入蛋白质水解酶，如胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、链霉蛋白酶等，使样品中的蛋白质降解.通常将其与Sevag法综合使用除蛋白质后果较好.2.1.1.5 盐酸法[23]：取样品浓缩液，用2mol/L盐酸调节其PH至3，放置过夜，在3000r/min条件下离心，弃去沉淀，即脱去蛋白质.另有李知敏[23]和叶将瑜[25]等人分别在植物多糖实验中证实：盐酸法、三氯乙酸法及Sevag法
脱蛋白率分别为72.5％、46.1％和42.3％，多糖的损失率分别为15.1%、6.1％和14.3％.盐酸法脱蛋白率高，但多糖的损失率也较高;三氯乙酸法较暖和，但除蛋白效力不高；Sevag 法的脱蛋白后果不及前两种.2.1.1.6 其它方法：可以加入5%ZnSO4溶液和饱和Ba（OH）2溶液，振荡后离心去蛋白.此法除蛋白不敷完整，可结合Sevag法使用.还可在提取液中加入50%的TCA溶液至沉淀完整，在4000r/min的条件下离心10min，收集上清液，即为除蛋白液.还有人使用4:1的氯仿-乙醇溶液除蛋白，将混合液清摇，再静置，取上清液.此过程需反复多次方可除尽蛋白.除去蛋白质的样品用紫外分光光度计检验，观察在280mm处是否有接收，如果无接收则标明蛋白质曾经除尽[24].2.1.2 除色素2.1.2.1活性炭（activated carbon）除色素[12]：活性炭属于非极性吸附剂，有着较强的吸附能力，特别适合于水溶性物资的分离.它的来源充足，价格廉价，上柱量大，适用于大量制备性分离.目前用于色谱分离的活性炭次要分为粉末状活性炭、颗粒状活性炭、锦纶活性炭三种.普通情况下，尽量防止用活性炭处理，因为活性炭会吸附多糖，形成多糖的损失.2.1.2.2对于植物来源的多糖，可能含有酚型化合物而色彩较深，这类色素大多呈负性离子，不克不及用活性炭接收剂脱色，可用弱碱性树脂DEAE纤维素或DuoliteA－7来吸附色素.2.1.2.3若糖和色素时结合的，易被DEAE纤维素吸附，
不克不及被水洗脱，这类色素可进行氧化脱色：以浓氨水或NaOH液调至PH8.0摆布，50℃。