鲤鱼过敏原_胶原蛋白_的体外模拟消化

第15卷第4期集美大学学报（自然科学版）Journal of Jimei University （Natural Science ）Vol.15No.4［收稿日期］2009－07－10［修回日期］2009－09－22
［基金项目］国家自然科学基金资助项目（30871947）；福建省自然科学基金资助项目（2008J0067）［作者简介］刘光明（1972—），男，副教授，博士，从事水产食品安全研究.通讯作者：苏文金（1956—），
男，教授，博士，从事海洋药物与食品方向研究.E-
mail ：wjsu@.［文章编号］1007－7405（2010）04－0027－05
鲤鱼过敏原（胶原蛋白）的体外模拟消化
刘光明1，2，钟永嘉1，2，曹敏杰1，2，蔡秋凤1，2，张凌晶1，2，苏文金
1，2（1.集美大学生物工程学院，福建厦门361021；2.福建省高校水产科学技术与食品安全重点实验室，福建厦门361021）
［摘要］首先采用酸法提取纯化鲤鱼过敏原（胶原蛋白），依据美国药典提供的模拟胃液、肠液配方，
分别利用胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶对纯化的胶原蛋白进行酶解消化，以SDS －PAGE 和免疫印
迹分析测定纯化的胶原蛋白在体外模拟胃液、肠液中的消化稳定性及免疫原性.结果表明，鲤鱼胶原蛋白
经模拟胃液（胃蛋白酶）消化15min 出现较为明显的降解，消化1h 的产物仍具有一定的免疫原性；经模
拟肠液（胰蛋白酶）消化30min 出现较为明显的降解，消化3h 的产物仍具有一定的免疫原性；经模拟肠
液（胰凝乳蛋白酶）消化1 4h 均未出现明显降解，其消化产物仍具有较强的免疫原性.结果提示，鲤鱼
胶原蛋白的耐消化性及免疫原性可能是导致食物性过敏反应的重要原因.
［关键词］鲤鱼；过敏原；胶原蛋白；模拟胃肠液消化；SDS －PAGE ；免疫印迹
［中图分类号］Q 512+.6［文献标志码］A
0引言
食物过敏是全世界普遍存在的一个食品安全问题，其症状在临床上表现为荨麻疹、哮喘、腹痛和腹
泻等，严重时可导致过敏性休克
［1－2］.1995年，联合国粮农组织（FAO ）报告，鱼类属于八大类常见过敏食物之一.在我国尤其是南方对鱼类过敏的发病率较高，如深圳250例过敏患者中对淡水鱼（鲤鱼）
过敏的阳性率为28.27%［3］.胶原蛋白在食品、化妆品中均有广泛应用
［4－7］，因食用含有胶原蛋白的各类食品而导致过敏的事件也屡见报道
［6－7］.2001年，日本学者Hamada 等首次报道胶原蛋白是海水鱼类的过敏原［8］，但有关淡水鱼类胶原蛋白尤其是作为食物过敏原的研究则很少，仅见文献［
9］.本文以我国有代表性的淡水鱼—
——鲤鱼为研究对象，采用酸法提取纯化胶原蛋白，依据美国药典提供的模拟胃液、肠液配方，分别利用胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶3种消化酶进行体外模拟胃肠液消化，并对消化产物进行SDS －PAGE 电泳和免疫印迹分析，以期获得淡水鱼过敏原（胶原蛋白）的相关基础数据，为降低胶原蛋白过敏性反应的发生、开发低过敏性的水产食品等提供理论基础.
1
材料与方法1.1材料
鲤鱼（Cyprinus carpio ）购于集美农贸市场，现杀，直接用于实验或置于－20ħ保存备用.胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶购自Pierce 公司.兔抗鲨鱼胶原蛋白抗体由本实验室制备.
1.2方法
1.2.1
胶原蛋白的提取纯化鱼皮胶原蛋白的提取
［9－10］：鱼皮称重，剪碎，加入20倍体积预冷的0.1mol /L NaOH ，4ħ浸泡4h ；滤去NaOH 溶液，用蒸馏水洗涤8次，沥干；加入等量的质量分数为10%的异丙醇溶液，4ħ
集美大学学报（自然科学版）第15卷浸泡1d ；滤去异丙醇溶液，用蒸馏水洗涤8次，沥干；加入等量的0.5mol /L HAc ，4ħ浸泡3d ；4ħ下20000r /min 离心30min ，取上清液；加入4mol /L NaCl 至终浓度为0.9mol /L ，4ħ静置1h ，4ħ下12000r /min 离心20min ，沉淀溶于25mmol /L 磷酸缓冲液中（pH =7.5）.
鱼肉胶原蛋白提取
［10－11］：鱼肉称重，加入10倍体积的20mmol /L Tris －HCl （pH =8.0），用组织捣碎仪均质；4ħ下12000r /min 离心15min ，取沉淀；加入10倍体积的0.1mol /L NaOH 溶解并均质，4ħ下12000r /min 离心15min ，取沉淀；用蒸馏水洗涤5次，加入3倍体积的0.5mol /L HAc 溶解并均质，4ħ下12000r /min 离心15min ，取上清液；加入4mol /L NaCl 至终浓度为0.6mol /L ，4ħ静置1h ，4ħ下12000r /min 离心20min ，取沉淀；加入0.5mol /L HAc 至沉淀完全溶解.
1.2.2体外模拟消化实验
模拟胃液（SGF ）和模拟肠液（SIF ）消化实验，依据美国药典配方［12］，参照Fu 等［13］的方法，
反应体积为1mL ，反应温度为37ħ，其中胃蛋白酶与胶原蛋白的比例为1ʒ20，胰蛋白酶（或胰凝乳蛋白酶）与胶原蛋白的比例为1ʒ30.
1.2.3SIF 消化的终止实验
依据美国药典配方，SIF 以胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶为消化酶，在NaOH 溶液（含6.8mg /mL KH 2PO 4，pH 值7.5）中进行，通常采用95ħ下加热5min 使酶失活终止［13］；为确定胶原蛋白是否对热稳定，本文进行了胶原蛋白的SIF 消化的终止实验（即95ħ热稳定性）.
1.2.4体外模拟消化产物的免疫印迹分析
Dot blot 参照文献［14］的方法进行.滴加2μL 纯化的胶原蛋白于硝酸纤维膜上，干燥后再滴加，共3次；脱脂奶封闭，加入一抗（兔抗鲨鱼胶原蛋白抗体，1ʒ100），加入二抗（山羊抗兔IgG －HRP ，1ʒ2000），DAB 显色，拍照保存.Western blot 参照文献［14］的方法进行，SDS －PAGE 凝胶
12M 34ku
200.0116.397.466.2茁琢１琢２说明：M 为蛋白质分子量标准；1—2为鱼皮胶原蛋白；3—4为鱼肉胶原蛋白.图1纯化的鱼皮和鱼肉胶原蛋白的SDS-PAGE 电泳图谱Fig.1SDS-PAGE analysis of the purified collagen from the skin and muscle of carp
电泳，湿法转膜，后续操作同Dot blot.
2
结果2.1胶原蛋白的提取纯化
对从鲤鱼中提取纯化的胶原蛋白进行SDS －PAGE 电泳分析，结果如图1所示，鱼肉、鱼皮中均可得到
纯化的胶原蛋白，二者的亚基构成和分子质量也较为
相似，都含有两条α链（α1和α2）和高浓度的β链，
α1、α2和β的分子质量依次约为130ku 、110ku 和
200ku.对比鱼皮和鱼肉胶原蛋白的提取结果还可以看
出，胶原蛋白在鱼皮中的含量明显高于鱼肉，因此后
续实验中均采用鱼皮胶原蛋白.
2.2SIF 消化胶原蛋白的终止实验
胶原蛋白的热稳定性实验结果显示，95ħ高温作
用1min 胶原蛋白开始降解，作用5min 后产生明显降
解，作用30min 胶原蛋白的3个亚基几乎完全降解，
表明胶原蛋白对热不稳定，因此不宜采用文献［9］的
95ħ高温终止SIF （胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶）消化
反应.本文后续SIF 实验采用的终止方法是：SIF 反应
后取样，立即加入蛋白质，上样缓冲液，进行样品SDS 化，这样既能防止高温对胶原蛋白的降解作用，
.·82·
第3期刘光明，等：鲤鱼过敏原（胶原蛋白）的体外模拟消化2.3胶原蛋白的SGF 消化
对纯化胶原蛋白的SGF 消化产物进行SDS －PAGE 电泳分析，结果如图2所示，SGF 消化开始后，胶原蛋白的3个亚基都发生了降解，其中β链降解较快，在α2链附近出现蛋白质条带加粗的现象；随着消化时间达到15min 时，α1链、α2链以及β链降解产物也逐渐被分解；当消化时间达到30min 时，胶原蛋白主要在80 100ku 处产生一系列的降解产物；当消化时间达到1h 时，胶原蛋白的3个亚基几乎完全分解，并出现约为30 40ku 的降解产物.
2.4胶原蛋白的SIF 消化
对纯化胶原蛋白的SIF （胰蛋白酶）消化产物进行SDS －PAGE 电泳分析，结果如图3所示，在胰蛋白酶作用30min 后，胶原蛋白的3个亚基都发生了降解；当消化时间达到1h 时出现明显降解，产生一些较大分子质量的降解产物（约为55ku 和45ku ）；当消化时间达到4h 时，3个亚基几乎完全降解，产生一些小分子质量的降解产物（约为35ku 和40ku ）.
对纯化胶原蛋白的SIF （胰凝乳蛋白酶）消化产物进行SDS －PAGE 电泳分析，结果发现，胰凝乳蛋白酶对胶原蛋白的分解作用不明显（消化时间达到4h 仍未出现明显降解），推测可能是由于未经过胃蛋白酶分解，胶原蛋白的胰凝乳蛋白酶作用位点没有完全暴露出来，因此未能发生明显的降解作用
.M 12345678200.0
116.3
97.4
66.2
45.0ku
说明：M —蛋白质分子量标准；1—0min ；2—1min ；
3—5min ；4—10min ；5—15min ；6—30min ；7—60min ；
8—对照（未加酶）.
图2SGF(pepsin)消化胶原蛋白的SDS-PAGE 电泳图谱
Fig.2SDS-PAGE analysis of SGF (pepsin)
digestion on the collagen from
carp M 12345678ku 9
116.066.245.035.0说明：M —蛋白质分子量标准；1—0min ；2—1min ；3—15min ；4—30min ；5—1h ；6—2h ；7—3h ；8—4h ；9—对照（未加酶）.图3SIF(trypsin)消化胶原蛋白的SDS-PAGE 电泳图谱Fig.3SDS-PAGE analysis of SIF (trypsin)digestion on the collagen from carp
2.5体外模拟消化产物的免疫印迹分析12345说明：1—对照（胶原蛋白未经消化处理）；2—胶原蛋白经胃蛋白酶消化1h 产物；3—胶原蛋白经胰蛋白酶消化3h 产物；4—胶原蛋白经胰凝乳蛋白酶消化4h 产物；5—牛血清蛋白经胃蛋白酶消化1h 的对照.图4点杂交分析胶原蛋白的体外模拟消化产物
Fig.4Dot blot analysis of the digested products from the purified collagen of carp
应用兔抗鲨鱼胶原蛋白抗体的Dot blot 分析鲤鱼
胶原蛋白的体外模拟消化产物的结果如图4所示，结
果表明，胶原蛋白经SGF （胃蛋白酶）作用1h 的产
物仍具有一定的免疫原性，经SIF （胰蛋白酶）作用
3h 的产物仍具有一定的免疫原性，经SIF （胰凝乳
蛋白酶）作用4h 的产物仍具有较强的免疫原性.
应用兔抗鲨鱼胶原蛋白抗体的Western blot 分析
胃蛋白酶消化胶原蛋白的结果表明，当消化时间为15min 时，3个亚基的杂交显色条带均有变淡，且在
α2的下面出现了其他的杂交显色条带；当消化时间为1h 时仍有模糊的杂交显色条带.胰蛋白酶消化胶原蛋白的Western blot 分析结果表明，当消化时间为15min 时，3个亚基的杂交显色条带没有多·
92·
集美大学学报（自然科学版）第15卷大的变化；当消化时间为30min 时，3个亚基的杂交显色条带才开始变淡；当消化时间为3h 时仍有较明显的杂交显色条带.胰凝乳蛋白酶消化胶原蛋白的Western blot 分析结果表明，随着消化反应的进行，直到消化时间为4h 时，3个亚基的杂交显色条带仍未发生明显变化.
3讨论
胶原蛋白是一种纤维状蛋白质，对称性差，分子结构类似于纤维，所以其溶解性较差
［4，6］.酸法提取，即在一定的酸性条件下提取胶原蛋白，使用的酸有盐酸、乙酸等.Kimura 等［4］采用盐酸和蛋
白酶结合的方法从海蛰中提取了胶原蛋白.Muyonga 等［6］用乙酸从Nileperch 幼鱼和成鱼鱼皮中提取
酸溶性胶原蛋白，得率分别为63.1%、58.7%.本文采用酸法提取鲤鱼胶原蛋白，并作了一些改进：1）提取过程中加入20倍体积预冷的0.1mol /L NaOH ，于4ħ浸泡4h ，用于去除非胶原蛋白成分并防止内源性蛋白酶的作用；2）加入等量的质量分数为10%的异丙醇溶液于4ħ浸泡1d ，用于去除鱼皮中脂肪.对比鲤鱼鱼肉与鱼皮的胶原蛋白提取结果，可以看出，鱼皮的胶原蛋白含量明显高于鱼肉，因此在实验中均以鱼皮胶原蛋白为消化对象.
加热和酶解能否破坏食物过敏原，影响因素主要有加热的温度与时间、酶解的时间、蛋白质和酶
的比例以及过敏原内部特性、二硫键的断裂及重新形成新的分子作用力等［15］.本文实验结果表明，
高温（95ħ）处理对胶原蛋白具有明显的降解作用，处理30min 时3个亚基几乎完全降解，说明胶原蛋白对热不稳定，因此不宜采用95ħ高温终止SIF （胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶）消化反应.
体外模拟消化实验结果表明，胃蛋白酶和胰蛋白酶可以在一定程度上消化胶原蛋白，其中胃蛋白酶作用15min 时有明显降解；胰蛋白酶作用30min 时有明显降解；胰凝乳蛋白酶对胶原蛋白消化1 4h 时均未见明显降解，原因可能是由于胶原蛋白未经胃蛋白酶消化，其胰凝乳蛋白酶的作用位点没有暴露出来.免疫印迹分析结果表明，胶原蛋白经胃蛋白酶消化1h 、胰蛋白酶消化3h 仍有一定的免疫原性，胶原蛋白经胰凝乳蛋白酶消化4h 仍有较强的免疫原性.
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The Vitro Simulated Digestion of Carp Allergens Collagen
LIU Guang-ming 1，2，ZHONG Yong-jia 1，2，CAO Min-jie 1，2，
CAI Qiu-feng 1，2，ZHANG Ling-jing 1，2，SU Wen-jin 1，
2（1.School of Biotechnology Engineering ，Jimei University ，Xiamen 361021，China ；2.Key Laboratory of Science and
Technology for Aquaculture and Food Safety （Jimei University ），Fujian Province ，Xiamen 361021，China ）
Abstract ：Firstly ，acid method was used to extract the collagen from the skin and muscle of carp.Then pepsin ，trypsin and chymotrypsin were used to digest the extracted collagen at different conditions based on the simulated gastric fluid's and intestinal fluid's formula provided by US pharmacopoeia.And the digested products were detected the digestion stability and immunogenicity in the simulated gastric fluid and intestinal fluid by SDS －PAGE and Western blot.It was found that the collagen could be digested by pepsin at 15min ，and it still had a certain degree of immunogenicity after 1h.The collagen could be digested by trypsin at 30min ，and it still had a certain degree of immunogenicity after 3h.The collagen wasn't almost digested by chymotrypsin at 1 4h ，and it still had the immunogenicity after 4h.These results suggested that the diges-tion stability and immunogenicity of carp collagen were the major cause to induce the food allergy.
Key words ：carp ；allergen ；collagen ；simulated gastric fluid and intestinal fluid ；SDS －PAGE ；Western blot
（责任编辑马建华）·13·。