激光共聚焦技术课件
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激光共聚焦技术课件
荧光探针的种类及应用
原位鉴定细胞或组织内生物大分子、观察细胞及亚 细胞形态结构
• 检测蛋白质、抗体及其他分子：荧光蛋白（GFP、
YFP等）
活体细胞或组织功能的实时动态监测
• 实时定量测定细胞内Ca2+变化：fluo-3/AM，fura-2
激光共聚焦技术课件
荧光探针标记样品的过程
样品预处理 给药、切片或细胞标本的制备 荧光探针标记样品
需有光路转换装置。即汞灯与激光转换，同时 汞灯光线强度可调。
荧光镜座要有防震动装置。
激光共聚焦技术课件
激光共聚焦显微镜工激作光共原聚焦理技示术课意件 图
激光经放大、 分光后由物镜 聚焦于焦平面 上，同时，焦 平面上被激光 扫描的点F所发 出的一定波长 的荧光通过检 测针孔光栏达 到检测器，并 成像于显示器 上，得到相应 的荧光图象。
激光共聚焦技术课件
目的蛋白细胞器定位观察
35S:GFP
Bright
a
GFP
b
Merged
c
35S:BrTTG1-GFP
d
e
f
TTG1在津田芜菁洋葱表皮细胞中的瞬时表达检测 A-C：GFP蛋白在洋葱表皮细胞中的表达；D-F：TTG1-GFP融合蛋白在洋葱表皮细胞中的表达； A、D：透射光下的表皮细胞；B、E：发射光下的洋葱表皮细胞；C、F：发射和透射复合光下的洋葱表皮细胞
激光共聚焦显微镜基本操作
获取共焦图像的步骤
在 VIS 模式中观察样品 装入 LSM 配置 扫描图像 保存图像
激光共聚焦技术课件
不同厚度光切图像
激光共聚焦技术课件
Z轴扫描
Z轴扫描、时间系列扫描
时间系列扫描
Z轴扫描＋时间系列扫描
激光共聚焦技术课件
组织和细胞样品中荧光的来源
自发荧光 荧光染色 免疫荧光－荧光抗体法产生荧光 外源性荧光物质进入组织细胞内产生荧光 酶致荧光
激光共聚焦技术课件
百合花粉管钙离子浓度梯度检测
液体培养基中培养百合花粉
观察花粉管生长情况，长度大概为花粉粒直径 的2－5倍，过长的花粉管会弯曲扭转不利于观 察。
激光共聚焦技术课件
荧光探针
Fluo-3（/AM）
属于单波长染料，用于测定钙离子的相对浓度。
Fluo-3/AM是fluo-3的一种乙酸甲酯衍生物， fluo 3/AM是脂溶性物质，能跨膜进入细胞。在细胞浆中 被水解脱掉AM后，变成游离的fluo-3，因其不具备 跨过完整细胞膜的特性因此停留在细胞内。
激光共聚焦技术课件
荧光样品的制备要求
荧光标记反应的特异性强、荧光定位准确 保持样品应有的结构形态完整性 荧光信号的响应准确、灵敏、具有可重复性 荧光强度适宜 荧光稳定性好 样品的荧光分布均匀 两种及两种以上的荧光信号之间荧光光谱交叉
可以消除 图象背景干净、干扰杂质少
激光共聚焦技术课件
游离配体形式的fluo-3是非荧光性的，但是当它与 Ca2＋结合后，形成具有荧光的fluo-3-Ca，是细胞 荧光强度增加40至80倍，而且其荧光强度与细胞内 [Ca2＋]呈正相关，因此可以得到Ca2＋浓度。
另外Fluo 3对于紫外光照射下可裂解的螯合钙或其 它形式的钙也有作用。
激光共聚焦技术课件
检测细胞间缝隙连接通 讯
检测细胞内活性氧物种 的产生
检测药物等跨膜进入组 织或细胞过程及其定位
检测荧光共振能量转移
检测细胞内脂肪
检测荧光漂白恢复
激光共聚焦技术课件
荧光显微镜系统
激光共聚焦显微镜所用的荧光显微镜大体 与常规荧光显微镜相同，但又有其特点。
需与扫描器连接。使激光能进入显微镜物镜照 射样品，并使样品发射的荧光到达检测器。
刘炜等，低温处理对冬、春小麦细 胞Ca2 + 时空变化的影响，植物学报， 2001，43 (12) :1218 －1223
激光共聚焦技术课件
A
B
C
D
图11-4 荧光蛋白扫描结果 A,B 检测CFP 发现目的基因在核膜上表达 C,D 检测CFP 发现目的基因在核膜上和胞浆中表达
激光共聚焦技术课件
目的蛋白细胞器定位观察
含有荧光蛋白的载体pA7-GFP 目的基因 洋葱表皮
激光共聚焦技术课件
目的蛋白细胞器定位观察
含有荧光蛋白的载体pA7-GFP
CaMV 35S Promoter
XhoI,NcoI,SalI,SpeI GFP
XbaI,SmaI,BamHI
目的基因
激光共聚焦技术课件
目的蛋白细胞器定位观察
对提取的质粒，用目的基因的引物进行PCR鉴定，出现了目的 片段。 根据pA7-GFP Vector上提供的酶切位点，对重组质粒进行双酶 切，酶切后进行电泳分析，也出现了目的片段，表明目的片段 已经和质粒DNA重组。
分子生物学课件
激光共聚焦显微镜应用技术 －－蛋白的细胞器定位
Confocal Laser Scanning Microscopy
激光共聚焦技术课件
激光共聚焦显微镜的基本结构
Zeiss LSM 510 META
激光光源 冷却系统 扫描器 光学装置 荧光显微镜系统 图象存储与处理及控制系统
针孔光栏 分光镜 发射荧光单色激器光检共测聚器焦技术课件
Projection
激光共聚焦技术课件
save “projection”
图7～10. 7. 连续降温下生成 Ca2 + 荧光随时间变化的曲线 同时记录的荧光图像, 显示冬 小麦胞内荧光有相同的变化趋 势。8. 连续降温下生成Ca2 + 荧光随时间变化的曲线同时记 录的荧光图像, 显示春小麦胞 内荧光有相同的变化趋势。9. Fluo-3/ AM染色后,静息态下冬 小麦原生质体的三维重组图像。 10. Fluo-3/ AM染色后,静息态 下春小麦原生质体的三维重组 图像。
图3-9 pA7-TTG1重组质粒酶切鉴定及PCR鉴定 酶切：重组质粒酶切产物；M：Marker DL 2000；PCR：重组质粒PCR产物
激光共聚焦技术课件
目的蛋白细胞器定位观察
含TTG1的瞬时表达载体转入洋葱表皮细胞
(1)将提取好的的含有目的基因的瞬时表达载体以及pA7-GFP载体约20 μL分别 加入1.5 mL离心管中，分别加入500 μL的蒸馏水，两管分别标号P1，P2。 (2) 分别取4片约1.5 cm*1.5 cm大小的洋葱表皮放入P1，P2。 (3)将P1，P2管管盖打开，用封口膜将其封上，扎两到三个小孔。 (4)将P1，P2管进行抽真空，抽到刚刚沸腾为止，一共抽三次。 (5)取MS培养基并在其上铺上一层滤纸。 (6)取出P1，P2管中的洋葱表皮，将其铺在MS培养基的滤纸上，加少量的水 培养16小时。
激光共聚焦技术课件
激光共聚焦显微镜在生物学中的应用
原位鉴定细胞或组织内 活体细胞或组织功能的
生定量测定细胞内
检测核酸
Ca2+变化
检测蛋白质细胞定位
测定细胞内pH变化
检测细胞凋亡
检测膜电位变化
细胞器的观察及测定 检测细胞融合 观察细胞骨架
激光扫描共聚焦显微镜（LSM）是当 今世界上最先进的分子生物学分析仪 器之一。
它是在荧光显微镜成像的基础上加装 了激光扫描装置，利用计算机进行图 像处理，使用紫外光或激光激发荧光 探针，从而得到细胞或组织内部微细 结构的荧光图像，观察细胞的形态变 化或生理功能的改变。
成为形态学、分子细胞生物学、神经 科学、药理学和遗传学等领域中新的 有力研究工具。
荧光探针的种类及应用
原位鉴定细胞或组织内生物大分子、观察细胞及亚 细胞形态结构
• 检测蛋白质、抗体及其他分子：荧光蛋白（GFP、
YFP等）
活体细胞或组织功能的实时动态监测
• 实时定量测定细胞内Ca2+变化：fluo-3/AM，fura-2
激光共聚焦技术课件
荧光探针标记样品的过程
样品预处理 给药、切片或细胞标本的制备 荧光探针标记样品
需有光路转换装置。即汞灯与激光转换，同时 汞灯光线强度可调。
荧光镜座要有防震动装置。
激光共聚焦技术课件
激光共聚焦显微镜工激作光共原聚焦理技示术课意件 图
激光经放大、 分光后由物镜 聚焦于焦平面 上，同时，焦 平面上被激光 扫描的点F所发 出的一定波长 的荧光通过检 测针孔光栏达 到检测器，并 成像于显示器 上，得到相应 的荧光图象。
激光共聚焦技术课件
目的蛋白细胞器定位观察
35S:GFP
Bright
a
GFP
b
Merged
c
35S:BrTTG1-GFP
d
e
f
TTG1在津田芜菁洋葱表皮细胞中的瞬时表达检测 A-C：GFP蛋白在洋葱表皮细胞中的表达；D-F：TTG1-GFP融合蛋白在洋葱表皮细胞中的表达； A、D：透射光下的表皮细胞；B、E：发射光下的洋葱表皮细胞；C、F：发射和透射复合光下的洋葱表皮细胞
激光共聚焦显微镜基本操作
获取共焦图像的步骤
在 VIS 模式中观察样品 装入 LSM 配置 扫描图像 保存图像
激光共聚焦技术课件
不同厚度光切图像
激光共聚焦技术课件
Z轴扫描
Z轴扫描、时间系列扫描
时间系列扫描
Z轴扫描＋时间系列扫描
激光共聚焦技术课件
组织和细胞样品中荧光的来源
自发荧光 荧光染色 免疫荧光－荧光抗体法产生荧光 外源性荧光物质进入组织细胞内产生荧光 酶致荧光
激光共聚焦技术课件
百合花粉管钙离子浓度梯度检测
液体培养基中培养百合花粉
观察花粉管生长情况，长度大概为花粉粒直径 的2－5倍，过长的花粉管会弯曲扭转不利于观 察。
激光共聚焦技术课件
荧光探针
Fluo-3（/AM）
属于单波长染料，用于测定钙离子的相对浓度。
Fluo-3/AM是fluo-3的一种乙酸甲酯衍生物， fluo 3/AM是脂溶性物质，能跨膜进入细胞。在细胞浆中 被水解脱掉AM后，变成游离的fluo-3，因其不具备 跨过完整细胞膜的特性因此停留在细胞内。
激光共聚焦技术课件
荧光样品的制备要求
荧光标记反应的特异性强、荧光定位准确 保持样品应有的结构形态完整性 荧光信号的响应准确、灵敏、具有可重复性 荧光强度适宜 荧光稳定性好 样品的荧光分布均匀 两种及两种以上的荧光信号之间荧光光谱交叉
可以消除 图象背景干净、干扰杂质少
激光共聚焦技术课件
游离配体形式的fluo-3是非荧光性的，但是当它与 Ca2＋结合后，形成具有荧光的fluo-3-Ca，是细胞 荧光强度增加40至80倍，而且其荧光强度与细胞内 [Ca2＋]呈正相关，因此可以得到Ca2＋浓度。
另外Fluo 3对于紫外光照射下可裂解的螯合钙或其 它形式的钙也有作用。
激光共聚焦技术课件
检测细胞间缝隙连接通 讯
检测细胞内活性氧物种 的产生
检测药物等跨膜进入组 织或细胞过程及其定位
检测荧光共振能量转移
检测细胞内脂肪
检测荧光漂白恢复
激光共聚焦技术课件
荧光显微镜系统
激光共聚焦显微镜所用的荧光显微镜大体 与常规荧光显微镜相同，但又有其特点。
需与扫描器连接。使激光能进入显微镜物镜照 射样品，并使样品发射的荧光到达检测器。
刘炜等，低温处理对冬、春小麦细 胞Ca2 + 时空变化的影响，植物学报， 2001，43 (12) :1218 －1223
激光共聚焦技术课件
A
B
C
D
图11-4 荧光蛋白扫描结果 A,B 检测CFP 发现目的基因在核膜上表达 C,D 检测CFP 发现目的基因在核膜上和胞浆中表达
激光共聚焦技术课件
目的蛋白细胞器定位观察
含有荧光蛋白的载体pA7-GFP 目的基因 洋葱表皮
激光共聚焦技术课件
目的蛋白细胞器定位观察
含有荧光蛋白的载体pA7-GFP
CaMV 35S Promoter
XhoI,NcoI,SalI,SpeI GFP
XbaI,SmaI,BamHI
目的基因
激光共聚焦技术课件
目的蛋白细胞器定位观察
对提取的质粒，用目的基因的引物进行PCR鉴定，出现了目的 片段。 根据pA7-GFP Vector上提供的酶切位点，对重组质粒进行双酶 切，酶切后进行电泳分析，也出现了目的片段，表明目的片段 已经和质粒DNA重组。
分子生物学课件
激光共聚焦显微镜应用技术 －－蛋白的细胞器定位
Confocal Laser Scanning Microscopy
激光共聚焦技术课件
激光共聚焦显微镜的基本结构
Zeiss LSM 510 META
激光光源 冷却系统 扫描器 光学装置 荧光显微镜系统 图象存储与处理及控制系统
针孔光栏 分光镜 发射荧光单色激器光检共测聚器焦技术课件
Projection
激光共聚焦技术课件
save “projection”
图7～10. 7. 连续降温下生成 Ca2 + 荧光随时间变化的曲线 同时记录的荧光图像, 显示冬 小麦胞内荧光有相同的变化趋 势。8. 连续降温下生成Ca2 + 荧光随时间变化的曲线同时记 录的荧光图像, 显示春小麦胞 内荧光有相同的变化趋势。9. Fluo-3/ AM染色后,静息态下冬 小麦原生质体的三维重组图像。 10. Fluo-3/ AM染色后,静息态 下春小麦原生质体的三维重组 图像。
图3-9 pA7-TTG1重组质粒酶切鉴定及PCR鉴定 酶切：重组质粒酶切产物；M：Marker DL 2000；PCR：重组质粒PCR产物
激光共聚焦技术课件
目的蛋白细胞器定位观察
含TTG1的瞬时表达载体转入洋葱表皮细胞
(1)将提取好的的含有目的基因的瞬时表达载体以及pA7-GFP载体约20 μL分别 加入1.5 mL离心管中，分别加入500 μL的蒸馏水，两管分别标号P1，P2。 (2) 分别取4片约1.5 cm*1.5 cm大小的洋葱表皮放入P1，P2。 (3)将P1，P2管管盖打开，用封口膜将其封上，扎两到三个小孔。 (4)将P1，P2管进行抽真空，抽到刚刚沸腾为止，一共抽三次。 (5)取MS培养基并在其上铺上一层滤纸。 (6)取出P1，P2管中的洋葱表皮，将其铺在MS培养基的滤纸上，加少量的水 培养16小时。
激光共聚焦技术课件
激光共聚焦显微镜在生物学中的应用
原位鉴定细胞或组织内 活体细胞或组织功能的
生定量测定细胞内
检测核酸
Ca2+变化
检测蛋白质细胞定位
测定细胞内pH变化
检测细胞凋亡
检测膜电位变化
细胞器的观察及测定 检测细胞融合 观察细胞骨架
激光扫描共聚焦显微镜（LSM）是当 今世界上最先进的分子生物学分析仪 器之一。
它是在荧光显微镜成像的基础上加装 了激光扫描装置，利用计算机进行图 像处理，使用紫外光或激光激发荧光 探针，从而得到细胞或组织内部微细 结构的荧光图像，观察细胞的形态变 化或生理功能的改变。
成为形态学、分子细胞生物学、神经 科学、药理学和遗传学等领域中新的 有力研究工具。