暨南大学徐明芳-第三章细胞的破碎和分离_20...

3.3 细胞破碎技术—匀浆法
2)、液体剪切法(最常用的方法之一)
操作
JJ-2组织捣碎匀浆机
高压匀浆法是液体剪切破碎方法中的一种。它的主要设备是 高压匀浆机，
高压匀浆法是液体剪 切破碎方法中的一种。 它的主要设备是高压 匀浆机，它有一个高 压位移泵和一个可调 节进料速度的针形阀 （见图）。当菌体悬 浮液经过高压泵加压 后，通过阀芯与阀座 之间的通道时，悬浮 液突然改变方向，向 球撞击。在通过阀门 时产生高剪应力，向 环撞击时产生巨大的 冲击力，将细胞破碎， 然后排出 高压匀浆机的排出阀装置
3.1 分 类
物理法 化学法
固体剪切法(珠磨法) 液体剪切法
撞击法 超声法 渗透法
酶溶法 化学降解法（酸碱法）
表面活性剂法 有机溶剂膨胀法 萃取法

3.1节回顾一下细胞壁的结构。从中可知，在大规模 生产中，细胞破碎方法是十分有用的。
我们很容易将这些方法划分为两大类，化学法和机 械法。 化学法我们将在后面作详细介绍，有渗透冲击法、 表面活性剂增溶法或有机溶剂溶解法。这些化学法 较温和，细胞破坏后产物也不会不可逆的变性，规 模也容易放大：如果需要处理10倍量的生物有机体， 只需要加入10倍的化学药品剂量。
3.3 细胞破碎技术
计算
服从一级反应定律 式中，R为pro释放量，Rm为pro最大释放量.
影响因素
操作压力p：p, R ;相反, R 。温度 2C /10MPa 。 破碎次数N：N，R 。 温度：比速度k与温度有关，温度25C，k1.5倍。 细胞抗破碎系数a：a酵母=2.9，a大肠杆菌 = 2.1。 细胞种类：影响k值。 细胞浓度： Z：常数，p0：破碎所需的最低压力，：细胞浓度的参数。
3.3 细胞破碎技术
–珠磨法
1)、固体剪切法(珠磨法, c最有效的物理破碎法) 操作简介
3. Crushing in ball mill 珠磨法
WSK卧式高效全能珠磨机
ZM系列卧式密闭珠(砂)磨机
图2-5 Netzsch Molinex KE5搅拌磨
图2-6 Netzsh LM20砂磨机
3.3 细胞破碎技术
3.6 细胞破碎的评价--直接计数法
3.3 细胞破碎技术
阀门底座：刃缘阀座，平边阀座
优点
A、在大规模cell破碎中，高压匀浆机和珠磨机用得最多; B、高压匀浆机最适合于酵母和细菌; C、珠磨机可用于酵母和细菌，但对真菌菌丝和藻类更合适.
3.3 细胞破碎技术—撞击破碎法
3) 撞击破碎法
操作：细胞喷雾高速冻结 300 m/s氮气流
优点：
3.3 细胞破碎技术
f、不同流量和搅拌速度下的效率。-20，-50，100 10-6 m3/s 流量；1–8， 2–10， 3–15， 4–20 m/s 外缘 速度
g. 微生物特性

一般来说酵母比细菌细胞处理效果好。因 为细菌细胞仅为酵母细胞的十分之一，而 且细菌细胞的机械强度比酵母要高。 一台20L球磨机在最适条件下，每小时可加 工200kg面包酵母，而在同样条件下，处理 细菌细胞仅为10～20kg。
A、细胞破碎仅发生在撞击的一瞬间，破碎程度均匀，避免反 复和过度破碎； B、破碎的程度可无级调节，避免细胞内部结构的破坏，特别 适合于细胞器的回收； C、实验室和工业规模均可应用，细胞浓度在10-20%，实验 室规模的间歇处理能力在50-500 mL/h，工业规模的连续处 理在 10,000 mL/h 以上。
A、提取产物在细胞质内，用机械法破碎 B、提取产物在细胞膜附近，用化学法 C、提取产物与细胞膜和细胞壁结合，可采用化学法和机械 法结合的方法
破碎技术杂交研究应注意的问题
A、杂交技术可产生很大优势。如 B、破碎技术对下游分离技术的影响。破碎颗粒清除，产物 的分离纯化 C、在发酵阶段，考虑到发酵过程和环境对破碎难易程度的 影响 D、菌种的培育，胞内产物 胞外产物
计算 破碎遵循一级动力学定律, 即
对上述方程积分得 对于n次连续搅拌研磨操作，则得蛋白质的物料平衡式
：平均停留时间，V：磨腔的总体积，Q：发酵液的流量。
3.3 细胞破碎技术
影响因素
a) 转盘外缘速度(见下图)： 适合条件：圆盘外缘速度 < 20 m/s, 一般在 5-15 m/s。
b) 珠粒添量和大小 添量：(见上图，添量体积一般占总体积的80-90%) 粒径：一般在0.2mm(实验室), < 0.4 mm(工业)。最终由实验确定
3.3 细胞破碎技术--超声破碎法
4) 超声破碎法(15—25kHz)
2. Ultrasonication 超声波
超声波破碎仪
3.3 细胞破碎技术--超声破碎法
机理 在超声作用下产生的空穴化作用(cavitation)，空 穴的形成和闭合产生极大的冲击波和剪切力。
优点：适合于多种细胞的破碎
缺点：A、影响因素多，如振幅、黏度、表面张力、 液体体积和流速、探头材料和形状；B、超声产 生超氧离子毒害作用；C、有效能量的利用率低； D、产热大，需控温；E、不易放大，仅应用于实 验室规模的细胞破碎。
胆盐作用于大 肠杆菌 甲苯破碎酵母 细胞
表 3.0-1. 细胞物理破碎法
方法 技术 原理 效果 成本 举例
机械法
匀浆法（片型）
研磨法 超声波法 匀浆法（孔型）
细胞被搅拌器劈碎 适中
细胞被研磨物磨碎 适中 用超声波的空穴作 适中 用使细胞破碎 须使细胞通过的小 剧烈 孔，使细胞受到剪 切力而破碎 细胞被玻璃珠或铁 剧烈 珠捣碎
3.3 细胞破碎技术—化学破碎法
5) 化学破碎法
酶溶法、酸碱法、有机溶剂胞溶法、表面活性剂法 酶溶法：利用酶分解细胞壁上特出的化学键，使细胞壁破碎。 优点： A、产品释放的选择性； B、提取速度和收效高； C、产品的破坏小； D、对外界环境，如pH和温度等要求低； E、不残留细胞碎片。
3.4 物理法和化学法的比较

革兰氏阴性细胞结构如图所示。有三层：最外层
约8mm厚，酶大多数镶嵌在这层膜上。

革兰氏阳性原核生物缺少最外层结构，但有第二
层肽聚糖层和胞浆空间。
革兰氏阳性菌细胞壁较厚，约20～80nm。含15～50
层肽聚糖片层，每层厚度1nm，约占细胞干重的
50%～80%。此外，尚有壁磷壁酸和膜磷壁酸。
革兰氏阴性菌细胞壁细胞壁较薄，有1～2层肽聚糖片，在 肽聚糖层外尚有脂蛋白、脂质双层、脂多糖三部分。脂蛋白的 功能是将外膜固定于肽聚糖层，脂类和蛋白质等在稳定细胞结 构上非常重要，如果被抽提，细胞壁将变得很不牢固。
剪切力F: 假定细胞直径为d(in: m)，维持球体所需的综合维 持力为(in: N/m)，则破碎细胞所需F(in: Pa)为
如利用流体剪切力(Pa)的作用，则在牛顿流体中 则破碎细胞所需的速度梯度为：
3.2 细胞破碎理论
意义：细胞直径，所需压力或剪切力，破碎难度。 渗透压法：渗透压差()为 c=细胞内外小分子的浓度差，R=气体常数，T = 绝对温度。
细胞壁组成
图2-1 细菌细胞壁的主要组分
藻类细胞壁的结构与组成
藻类的细胞壁更为复杂，其主要结构成份，是纤丝状的多糖类 物质。
酵 母 细 胞 壁 的 结 构 示 意 图
M-甘露聚糠；P-磷酸二脂键；G-葡聚糠
3.2 细胞破碎理论
1)、细胞破碎
A 压撞 B 剪切 Ca 渗透 Cb 冻胀 D 破壁破膜
d) 细胞浓度x：最佳x由实验确定。一般产热量随细胞浓度的 降低而下降，但单位细胞重量的能耗 。
e) 破碎效率： R：每kg成品细胞(如酵母)释放的蛋白量，Q：物料流量， P’：珠磨机消耗的功率。 破碎率是选择细胞破 碎设备的重要依据之 f) 流量Q：破碎为一级反应。 一。 Q, E，R； Q，E，R。

大多数情况下，抗生素，胞外酶，一些多糖，
及氨基酸等目标产物存在于在发酵液中。在上述
过程中，需被分离的发酵液可被看作一种副产物 来处理，以此分离和纯化产物。

有些目标产物不在发酵液中，而是存在于生物体中。
尤其是由基因工程菌产生的大多数蛋白质不会被分
泌到发酵液中，而是在细胞内沉积。

脂类物质和一些抗生素也是包含在生物体中。还
※ 3.0 Summary
概述
※ 3.1 Cell Membranes 细胞膜
※ 3.2 Chemical Methods
化学破碎方法
※ 3.3 mechanical disruption 机械破碎

生物分离的第一步是将生物机体从发酵液中分离，
通常使用过滤和离心等方法，这在第二、三章中 已有陈述。
Chapter 3
Cell Disruption
第三章 细胞破碎
第三章 细胞的破碎和分离
3.1 3.2 3.3 3.4 3.5 3.6 3.7 3.8 分类 细胞破碎理论 细胞破碎技术 物理法和化学法的比较 破碎方法的选择 细胞破碎的评价 基因工程表达产物 包涵体
思考题
1.影响珠磨细胞破碎法的主要因素？ 2.珠磨法与高压匀浆细胞破碎方法有哪些 区别？ 3.细胞破碎的评价主要采用两种方法各有 何优缺点 ？ 4.综述包涵体形成的原因，如何获得包涵 体活性目标蛋白？ 5.简述基因工程产品人-干扰素分离过程。
2)、产物释放
如细胞破碎速度与未破碎细胞浓度成正比，则有
3.2 细胞破碎理论
如破碎cell产物释放的速度与cell内外的浓度差成正比，则有
cm为产物的最大释放浓度，x0为起始细胞浓度，从上三式得
上式为两步释放的速度方程，如细胞破碎或产物释放的其中 一步很快，则表现为一级动力学释放过程，此时方程为 破碎速度控制过程： 释放速度控制方程：


表 3.0-1. 细胞化学破碎法
方法
技术
原理
效果
成本
举例
化学法
渗透冲击
酶消化法 增溶法 脂溶法 碱处理法
渗透压破坏细胞
细胞壁被消化，使 细胞破碎 表面活性剂溶解细 胞壁 有机溶剂溶解细胞 壁并使之失稳 碱的皂化作用使细 胞壁融解
温和
温和 温和 适中 剧烈
便宜
昂贵 适中 便宜 便宜
血红细胞的破 坏
细胞壁的破碎
细胞破碎的方法很多，在诸多破碎方法中，机械法中的球磨机
和高压匀浆机不仅在实验室而且在工业得到应用。其它的方法大多
尚停留在实验室应用，工业化的应用还在探索之中。
一、球磨法
球磨机是破碎微生物细胞的常用设备，一般有立式
或卧式两种，在磨腔中装入小玻璃球或小钢球，由电动机
带动搅拌碟片高速搅拌微生物细胞悬浮物和小磨球而产生 剪切力，将细胞破碎。
有一些目标产物就是细胞本身，如面包酵母。

还有，产物如类固醇不必通过细胞破碎提取。大
多数情况下，产物还是包裹在生物体内，属胞内产
物。

.

使胞内产物释放出来一般需要破碎细胞壁，这也是
这一章的主题。

细胞破碎的方法在生物化学领域中得到了很广泛的
运用，但多数在小规模生产中，在大规模生产尤其
是基因工程中应用极少。
物理破碎法缺点：
A、高能、高温、高噪音、高剪切力(四高)，易使产品变性 失活； B、非专一性，胞内产物均释放，分离纯化困难； C、细胞碎片大小不一，难分离。
Hale Waihona Puke 化学破碎法缺点：A、费用高； B、引起新的污染，尤其是其他化学方法； C、一般只有有限的破碎，常需与其他物理法连用。
3.5 破碎方法的选择
选择的一般原则
细胞膜结构

现在所有的关于细胞膜结构的基本知识，并不能为 细胞破碎方法提供基本的引导。也许将来可以。正 因如此，对此进行提纲切领的介绍很有必要。主要
强调的是革兰氏阴性原核生物。其细胞结构中没有
细胞核：基因物质位于单链DNA上。典型的生物是
大肠杆菌，是生物技术研究的主体。通过这种细胞
生产了很多细胞重组的产物。
适中
便宜 昂贵 适中
动物组织及动 物细胞
细胞悬浮液小 规模处理 细胞悬浮液大 规模处理 细胞悬浮液和 植物细胞的大 规模处理
珠磨破碎法
便宜
机械法主要有匀浆法和研磨法

这两种方法中，细胞通过高的机械剪切力被破坏。
热量的产生是该法的一个缺点，而且不容易规模放大:
如果一种方法可以在实验室规模下操作，我们并不知 道这种方法是否在大规模生产中可行。所以，这部分 内容仅作为实验的指导，而不是工程分析 。
磨球越小，细胞破碎速度越快。但磨球太小而漂浮，难以停留在磨 腔中
3.3 细胞破碎技术
c) 温度：温度在5-40C范围内对破碎影响较小。但研磨产热， 功率 ，温度 。如产物热不稳定，必须控温。 用NetzshLM20研磨和破碎酵母或细菌时，细胞浓度控制在 40%左右（产生的热量随浓度的增大而提高）